[发明专利]一种桃枝枯病菌的特异性PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种桃枝枯病菌的特异性PCR检测方法。采用特异性PCR引物组对该病菌特异性基因进行PCR扩增，反应体系包括：特异性PCR引物组、Green Taq Mix、菌丝基因组DNA、ddHsubgt;2/subgt;O；反应产物进行凝胶电泳分析，得到510bp目的片段为阳性，为桃枝枯病菌桃拟茎点霉(P.amygdali)。本发明所提供的桃枝枯病菌的特异性PCR鉴定方法，可以作为一种区别桃枝枯病菌及其属内、属外其他真菌的有效手段，优点在于快速、准确、灵敏、操作简便，具有非常高的实用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术，特别涉及一种桃枝枯病菌的特异性PCR检测方法。

背景技术

桃枝枯病已经成为桃的主要病害之一，发病桃树产量平均损失20-50％，严重时甚至整株枯死，给桃农带来巨大的经济损失，严重威胁着桃产业的健康发展。

截止目前，桃拟茎点霉(P.amygdali)是引起中国南方桃产区桃枝枯病的主要病原菌，除侵染桃外，还可侵染多种蔷薇科植物，如红叶李、翠冠梨、杏、苹果等；该病原菌也能侵染桃果，引起桃实腐病。此外，Botryosphaeria dothidea、Diaporthe eres、Phomopsisliquidambaris、Botryosphaeria obtuse、Leucostoma persoonia、Cytospora sp.等真菌也可引起该病害。为了预防和有效防控该病菌引起的桃枝枯病，迫切需要对该病原菌进行鉴定。形态学鉴定由于其不可靠、成本高、识别时间较长的缘故，使得该方法在很大程度上的检测是无效的，因此从分子水平建立对该病菌精确快速的检测方法，对于该病害的诊断以及防治具有非常重要的现实意义和应用价值。

虽然2011年上海农业科学院已经利用ITS作为靶标序列筛选出一对引物作为桃枝枯病菌P.amygdali的特异性PCR引物，但是这对引物仅区分了P.amygdali和P.sp.，因此非常有必要获得新的特异性引物组将其与拟茎点霉属内及属外其他真菌区分开，从而获得更加准确的信息，为病害的有效防控和预测提供实用价值。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供一种快速、简便的桃枝枯病菌的特异性PCR检测方法。

技术方案：本发明提供一种桃枝枯病菌的特异性PCR检测方法，包括如下步骤：

(1)桃枝枯病菌特异性基因的筛选；

(2)上述基因特异性PCR引物的筛选。

进一步地，所述桃枝枯病菌特异性基因号为GME6801，序列为SEQ ID NO.1。

进一步地，所述特异性PCR引物组为：

正引物Pa6801F：5’-acattgatcctaccgtgtttctc-3’；

反引物Pa6801R：5’-gcttggtcgggttgactttctta-3’。

进一步地，所述桃枝枯病菌的病原菌为桃拟茎点霉(P.amygdali)。

具体地，包括如下步骤：

(1)筛选该病菌特异性基因。

(2)筛选特异性PCR引物。

(3)提取真菌菌丝基因组DNA；

(4)按照反应体系配制溶液进行扩增，反应体系包括：特异性PCR引物组、菌丝基因组DNA、Green Taq Mix、ddH₂O；

(5)将上述扩增产物进行凝胶电泳分析，得到510bp目的片段为阳性，为桃枝枯病菌桃拟茎点霉(P.amygdali)，无条带为阴性对照。

所述真菌菌丝基因组DNA的提取，使用真菌基因组提取试剂盒(上海生工生物工程有限公司)。