[发明专利]一种透射电镜观察用原位体外培养细胞的样品处理方法

权利要求书

1.一种透射电镜观察用原位体外培养细胞的样品处理方法，其特征在于，包括以下过程：

S1、通过制备1~4%的琼脂凝胶置于细胞培养板或培养皿的孔底，并对所得琼脂凝胶进行酸化、漂洗及表面的阳离子活性处理；

S2、将待观察细胞接种于所得琼脂凝胶表面；

S3、对步骤S2所制备的样品进行后续处理，再经过锇酸固定、漂洗后，用手术刀和显微镊切去含有细胞生长的琼脂凝胶块，转移至另一培养板或培养皿中；

S4、对步骤S3所制备的样品进行后续脱水、渗透，并在胶囊型包埋板中进行样品包埋；

S5、随后进行常规的切片、染色及上机观察。

2.根据权利要求1所述的一种透射电镜观察用原位体外培养细胞的样品处理方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括以下过程：

S1-1、称取1~4克琼脂粉盛放于洁净玻璃锥形瓶中，加入100ml 双蒸水，经微波炉加热充分溶解后配制1~4%琼脂溶液；

S1-2、吸取上述尚未凝固的1~4%琼脂热溶液，琼脂热溶液的温度为45~60℃，添加至无菌细胞培养板的培养孔或细胞培养皿，吸取琼脂溶液量以溶液覆盖孔底或皿底深度2mm；

S1-3、将上述盛有琼脂溶液的细胞培养板或细胞培养皿静置在平整的台面，室温下待溶液冷却凝固；

S1-4、吸取2%冰醋酸至上述细胞培板或细胞培养皿中凝固的琼脂凝胶表面，室温下酸化处理3小时；

S1-5、弃去冰醋酸溶液，加入0.1mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS）静置漂洗10分钟，弃去洗液；

S1-6、重复上述漂洗环节3次，弃去漂洗液，自然晾干；

S1-7、在上述晾干的琼脂凝胶表面，加入 0.25%胰蛋白酶溶液进行琼脂凝胶表面的阳离子活性处理，室温静置2小时，或4℃过夜；

S1-8、弃去胰蛋白酶溶液，加入PBS漂洗10分钟；

S1-9、弃去上述漂洗液，重复漂洗2次，弃去漂洗液，室温自然晾干琼脂凝胶备用；

S1-10、将上述晾干的琼脂凝胶备在超净台内进行紫外辐照灭菌。

3.根据权利要求1所述的一种透射电镜观察用原位体外培养细胞的样品处理方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括以下过程：

S2-1、将待接种细胞，用培养该细胞所用的完全培养基调整成所需的细胞密度，制备待接种细胞的细胞悬液；

S2-2、吸取上述细胞密度的细胞悬液，添加至含有步骤S1所制备的琼脂凝胶的细胞培养板或细胞培养皿中，将步骤S2-1中所制备的具有细胞悬液的细胞培养板或细胞培养皿放置在37℃、饱和湿度、含5% C0₂的细胞培养箱中静置培养12~24h。

4.根据权利要求1所述的一种透射电镜观察用原位体外培养细胞的样品处理方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括以下过程：

S3-1、取出步骤S2的样品培养板或培养皿，弃去细胞培养液，PBS或其它渗液漂洗10分钟，共漂洗3次；

S3-2、加入2.5%~4% 戊二醛固定液，充分覆盖细胞表面，4℃固定过夜或室温固定2小时，弃去戊二醛溶液，PBS或其它渗液漂洗10~15分钟，共3~4次；弃去漂洗液，加入1%锇酸，室温避光固定2小时后，PBS或其它渗缓冲液漂洗10分钟，共计2次；

S3-3、利用手术刀或显微镊工具，轻轻将琼脂从培养板中切割挑出，保护琼脂凝胶的完整性，将含有细胞面朝上，置于另一细胞培养板或培养皿的孔底或皿底。