[发明专利]环介导等温扩增法检测烟草疫霉菌的引物及其检测方法在审
| 申请号： | 202111002922.2 | 申请日： | 2021-08-30 |
| 公开（公告）号： | CN113789401A | 公开（公告）日： | 2021-12-14 |
| 发明（设计）人： | 祖庆学;聂忠扬;林松;饶陈;张翼飞;杨超;刘杰;陈俊 | 申请（专利权）人： | 贵州省烟草公司贵阳市公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6895 | 分类号： | C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11 |
| 代理公司： | 贵阳中新专利商标事务所 52100 | 代理人： | 张行超 |
| 地址： | 550001 贵州省贵*** | 国省代码： | 贵州;52 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 环介导 等温 扩增 检测 烟草 霉菌 引物 及其 方法 | ||
1.环介导等温扩增法检测烟草疫霉菌的引物，其特征在于，所述的引物由B3、F3、FIP和BIP四条特异性引物组成，其核苷酸序列分别为：
B3：5’-GCGTTGGTAGGACTCTCCA-3’；
F3：5’-GGAGCATGGCTTCCTTCC-3’；
FIP：5’-TTCGACCAACAGCTTCGAGAGGACTCCGTCCTCGAAAAACAC-3’；
BIP：5’-GATGCTCAAGCGGCGAACCCCAAACTCCTCGTGCGTCAG-3’。
2.根据权利要求1所述的环介导等温扩增法检测烟草疫霉菌的引物，其特征在于，所述引物是根据烟草疫霉菌对烟草植株有明显作用的致病因子半胱氨酸蛋白酶基因PpCys45设计的。
3.利用权利要求1或2所述引物建立的烟草疫霉菌环介导等温扩增检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)待测样品的病原菌分离纯化；
(2)病原菌DNA提取；
(3)LAMP等温扩增：选取脱氧核糖酸扩增试剂盒、荧光目视检测试剂、病原菌DNA和所述四条特异性引物进行环介导等温扩增反应；
(4)结果判定：待反应结束后观察，如果产生肉眼可见的绿色荧光，则待测样品中含有烟草疫霉菌，如果不产生荧光，则待测样品中不具有烟草疫霉菌。
4.根据权利要求3所述的烟草疫霉菌环介导等温扩增检测的方法，其特征在于，所述LAMP等温扩增的反应体系为：以步骤(1)提取的DNA为模板，在PCR管中配制25.0μl，包括：2×反应缓冲液12.0μl，两条短引物B3和F3各4.0μl，两条长引物FIP和BIP各0.5μl，Bst DNA聚合酶1.0μl，荧光目视检测试剂1.0μl，以及模板DNA 2.0μl，将配制好的PCR管在60℃反应60min；80℃反应5min。
5.如权利要求1所述引物在检测烟草疫霉菌中的应用。
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