[发明专利]细胞色素P450功能研究及在灵芝三萜合成中的应用

权利要求书

1.一类灵芝三萜，其特征在于，包括：3,15-二羟基-羊毛甾-8,24-二烯-26-酸(15-hydroxy-ganoderic acid HLDOA)、灵芝酸Y(Ganoderic acid Y)、3,15,30-三羟基-羊毛甾-8,24-二烯-26-酸(15,30-dihydroxy-ganoderic acid HLDOA)、7-氧代-3,15-二羟基-羊毛甾-8,24-二烯-26-酸(7-oxo-15-hydroxy-ganoderic acid HLDOA)和24,25-二烷基-3,30-二羟基-羊毛甾-8-烯基-26-酸(24,25-dialkyl-30-hydroxy-ganoderic acidHLDOA)，其结构式依次为：

2.一种制备权利要求1所述灵芝三萜的方法，其特征在于，包括：通过P450基因GL21117催化灵芝酸Ganoderic acid HLDOA形成的新的灵芝三萜或通过P450基因GL21117与P450基因GL21117共同催化Ganoderic acid HLDOA形成的新的灵芝三萜，即将两个P450基因GL20421和GL21117分别或共同克隆到酿酒酵母过表达质粒中，并将酿酒酵母过表达质粒分别转化至重组改造后的微生物酿酒酵母中进行异源表达，通过对转化后的菌株进行发酵实现；

所述的P450基因GL20421的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，其氨基酸序列如Seq IDNo.2所示；所述的P450基因GL21117的核苷酸序列如Seq ID No.3所示，其氨基酸序列如SeqID No.4所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，包括以下任意一种：

A)将酿酒酵母表达质粒pRS426HF-GL21117-G418r转入酿酒酵母YL-T3中，形成经过重组改造后的酿酒酵母菌株YL-T3-CYP5150L8-iGLCPR-GL21117，将酵母表达质粒pRS426HF-G418r和pRS425-CYP5150L8-iGLCPR-Hygr转入酿酒酵母YL-T3中，从而形成对应的过表达GL21117的酿酒酵母菌株YL-T3-CYP5150L8-iGLCPR-GL21117；将构建好的酿酒酵母过表达菌株YL-T3-CYP5150L8-iGLCPR-GL21117进行发酵，从发酵产物中得到所述一类灵芝三萜；

B)将酿酒酵母表达质粒pRS426HF-GL21117-G418r和pRS425-GL20421-CYP5150L8-iGLCPR-Hygr转入酿酒酵母YL-T3中，形成经过重组改造后的酿酒酵母菌株YL-T3-GL20421-CYP5150L8-iGLCPR-GL21117；将酵母表达质粒pRS426HF-G418r和pRS425-GL20421-CYP5150L8-iGLCPR-Hygr转入酿酒酵母YL-T3中，从而形成对应的过表达GL21117和GL20421的酿酒酵母菌株YL-T3-GL20421-CYP5150L8-iGLCPR-GL21117；将构建好的酿酒酵母过表达菌株YL-T3-CYP5150L8-iGLCPR-GL21117和YL-T3-GL20421-CYP5150L8-iGLCPR-GL21117进行发酵，从发酵产物中得到所述一类灵芝三萜。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的酿酒酵母过表达质粒包括：pRS426HF-GL21117-G418r、pRS425-CYP5150L8-iGLCPR-Hygr和pRS425-GL20421-CYP5150L8-iGLCPR-Hygr。