[发明专利]一种环保的可逆的蛋白变性工艺

说明书

本发明公开了一种环保的可逆的蛋白变性工艺。采用不含氮的变性液溶解需变性的蛋白，得到的变性蛋白经过复性过程，仍能得到具备生物活性的蛋白。该工艺既经济又环保，可适用于工业化大生产。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为一种环保的可逆的蛋白变性工艺。

背景技术

大肠杆菌表达系统因其易于操作、遗传背景清楚、生产成本低和表达水平高等优点而在科研或生产中被广泛应用。然而，重组蛋白在大肠杆菌中的高水平表达常导致蛋白聚集而形成不溶性的、无活性的包涵体。因此，我们需要通过有效的变性和复性过程，将包涵体蛋白转变成具有生物活性的重组蛋白。

包涵体蛋白通常需要加入变性溶液，以破坏维持包涵体蛋白结构的分子内和分子间作用力，从而使多肽链伸展达到溶解包涵体的作用。一般常用的变性溶液中含有离液剂或去垢剂。常用的离液剂如6～8mol/L盐酸胍或尿素，可破坏包涵体蛋白间的氢键而使蛋白增溶。盐酸胍一般用来溶解一些附加值比较高的药物蛋白分子，不适用于工业化生产。尿素因其价格低廉而被广泛使用，但在工业化的包涵体蛋白变性过程中，尿素的大量使用会产生两个问题，首先，高浓度尿素溶解是不断吸热的过程，需持续控制设备温度，对变性罐体设计有一定的要求；其次，使用尿素或盐酸胍等含氮量很高的化合物(尿素含氮量46％，盐酸胍含氮量44％)，由于氮元素在原核包涵体蛋白变复性及后续纯化过程中均无法被利用，因此所产生的含氮废液会造成环境污染，必须进行回收处理，这对企业的环保审核及环评工作是极大的限制性因素。常用的去垢剂为SDS，其主要缺点是难于去除，从而对后续纯化和复性步骤产生干扰，一般不用于大规模生产。

发明内容概述

本发明的目的在于提供一种环保的可逆的蛋白变性工艺。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种可工业化的环保的可逆的蛋白变性方法，具体包括以下步骤：

将需变性的蛋白与变性溶液混合形成变性反应液，调节变性反应液的pH值使得蛋白变性，获得变性后的蛋白，其中所述变性溶液中没有含氮的物质，并且变性反应液的pH值被调节为至少11。

所述变形溶液包括1～30mmol/L的碳酸氢钠缓冲液或1～30mmol/L的碳酸钠缓冲液。

所述变性溶液包括0.1～10mmol/L EDTA。

所述变性溶液包括还原剂，所述还原剂选自以下组中的一种或多种：β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、三(2-羧乙基)膦；所述还原剂中每一种的浓度为0.05～30mmol/L。

所述变性反应液中不包括表面活性剂。

向所述变性反应液中加入碱性溶液来调节pH值，所述碱性溶液选自以下组中的一种：氢氧化钠、氢氧化钾；所述碱性溶液浓度为0.2～10mol/L。

所述的变性反应体系温度为15～40℃，较优选的温度为20～25℃。

所述的变性反应时间为15分钟以上和/或24小时以内。所述变性的蛋白溶液中的蛋白浓度为0.1～15g/L。

将所述的变性后的蛋白进行复性，获得具有生物活性的复性蛋白。

将所述的变性后的蛋白与复性溶液混合形成复性反应溶液，调节复性反应溶液pH值至7～12，使蛋白复性。

所述的复性反应温度为4～30℃，反应时间为2～48小时。

所述的复性溶液包括1～30mmol/L的碳酸氢钠缓冲液或碳酸钠缓冲液、1～50mmol/L甘氨酸缓冲液。