[发明专利]一种合成尿苷二磷酸-6-叠氮-D-半乳糖的方法

权利要求书

1.一种合成尿苷二磷酸-6-叠氮-D-半乳糖的方法，包括以下步骤：

S1，化合物6在双歧杆菌来源的半乳糖激酶的作用下转变为化合物12，其反应式如下所示：

优选地，其中，所述半乳糖激酶选自：长双歧杆菌来源的半乳糖激酶(BiGalK)或在BiGalK的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有BiGalK活性的由BiGalK衍生的蛋白质，齿双歧杆菌来源的半乳糖激酶，链状双歧杆菌来源的半乳糖激酶，小鸡双歧杆菌来源的半乳糖激酶，动物双歧杆菌来源的半乳糖激酶，两歧双歧杆菌来源的半乳糖激酶，星状双歧杆菌来源的半乳糖激酶，短双歧杆菌来源的半乳糖激酶，假长双歧杆菌来源的半乳糖激酶，假链状双歧杆菌来源的半乳糖激酶；

S2，在拟南芥来源的糖焦磷酸化酶(AtUSP)或在AtUSP的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有AtUSP活性的由AtUSP衍生的蛋白质的作用下，化合物12转变为尿苷二磷酸-6-叠氮-D-半乳糖1α，其反应式如下所示：

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述BiGalK的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述齿双歧杆菌来源的半乳糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述链状双歧杆菌来源的半乳糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述小鸡双歧杆菌来源的半乳糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；所述动物双歧杆菌来源的半乳糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；所述两歧双歧杆菌来源的半乳糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述星状双歧杆菌来源的半乳糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；所述短双歧杆菌来源的半乳糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；所述假长双歧杆菌来源的半乳糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；所述假链状双歧杆菌来源的半乳糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，编码所述BiGalK的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。

4.根据权利要求1所述的方法，

其中，步骤S1中，所述反应在三磷酸腺苷和金属Mg²⁺存在条件下进行，和/或

其中，步骤S1中，所述反应体系的pH值为6至9，优选为7.5。

5.根据权利要求1所述的方法，步骤S2中，所述AtUSP的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，优选地，编码所述AtUSP的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。

6.根据权利要求1所述的方法，

其中，步骤S2中，所述反应在三磷酸尿苷和金属Mg²⁺存在条件下进行，和/或

其中，步骤S2中，所述反应体系的pH值为6至9，优选为约7.5。

7.根据权利要求1所述的方法，步骤S2中，进一步使用无机焦磷酸化酶(PPA)或在PPA的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有PPA活性的由PPA衍生的蛋白质。

8.根据权利要求1所述的方法，步骤S2中，所述PPA的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，优选地，编码所述PPA的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。

9.一种合成尿苷二磷酸-6-叠氮-D-半乳糖的方法，包括以下步骤：

将化合物6、三磷酸腺苷、三磷酸尿苷作为底物，在金属Mg²⁺存在下，在权利要求1中步骤S1中所述的双歧杆菌来源的半乳糖激酶和步骤S2中所述的拟南芥来源的糖焦磷酸化酶(AtUSP)或在AtUSP的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有AtUSP活性的由AtUSP衍生的蛋白质、和任选的无机焦磷酸化酶(PPA)或在PPA的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有PPA活性的由PPA衍生的蛋白质的作用下，催化合成尿苷二磷酸-6-叠氮-D-半乳糖，其反应式如下：

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，进一步包括分离纯化步骤，优选地，所述纯化步骤包括：在上述催化合成反应结束后，加入乙醇，固液分离，液体减压脱除溶剂，然后用去离子水溶解，聚丙烯酰胺凝胶柱(P-2)分离，薄层色谱法(TLC)检测分离效果；合并包含产物的组分，减压脱除溶剂，用去离子水溶解后，琼脂糖凝胶(QS-FF)离子交换柱分离，去除杂质；将含有产物的组分合并，减压脱除溶剂，然后用去离子水溶解，P-2凝胶柱分离收集含有产物的组分，优选经浓缩冻干，得到目标产物。