[发明专利]一种转化乳糖生成乳果糖的植物乳杆菌工程菌株及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种转化乳糖生成乳果糖的植物乳杆菌工程菌株，其特征在于，是以敲除β-半乳糖苷酶编码基因lacA和lacLM的植物乳杆菌为基础，插入纤维二糖2-差向异构酶的编码基因；

所述敲除β-半乳糖苷酶编码基因lacA和lacLM的植物乳杆菌为植物乳杆菌NZ0203，按照如下方法制备得到；

(1)提取植物乳杆菌WCFS1(Lactobacillus plantarum WCFS1)的基因组DNA；

(2)以步骤(1)的基因组DNA为模板，利用PCR扩增技术扩增基因lacA的上游同源臂和lacA的下游同源臂；然后利用重叠拼接PCR的方法，对lacA的上游同源臂和lacA的下游同源臂进行连接，制得lacA基因敲除连接臂；

(3)使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤(2)中制得的lacA基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，挑取验证正确的转化子，提取重组质粒；

(4)将步骤(3)得到的重组质粒转化入植物乳杆菌WCFS1中，通过转化子培养发生第一次同源交换，利用红霉素进行筛选，然后进行连续传代发生第二次同源交换，筛选红霉素标记丢失的菌株，经PCR扩增验证后得到lacA基因敲除菌株；

(5)以步骤(1)获得的基因组DNA为模板，利用PCR扩增技术扩增基因lacLM的上游同源臂和lacLM的下游同源臂，之后利用重叠拼接PCR的方法，对lacLM的上游同源臂和lacLM的下游同源臂进行连接，制得lacLM基因敲除连接臂；

(6)使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤(5)中制得的lacLM基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，挑取验证正确的转化子，提取重组质粒；

(7)将步骤(6)得到的重组质粒转化入步骤(4)敲除lacA基因的植物乳杆菌WCFS1中，通过转化子培养发生第一次同源交换的菌体，利用红霉素进行筛选，然后进行连续传代发生第二次同源交换，筛选红霉素标记丢失的菌株，经PCR扩增验证后得到同时敲除lacA和lacLM的植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌NZ0203；

所述植物乳杆菌NZ0203不能利用乳糖和乳果糖；

所述纤维二糖2-差向异构酶来源于解糖热解纤维素菌(Caldicellulosiruptorsaccharolyticus)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，插入的纤维二糖2-差向异构酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的转化乳糖生成乳果糖的植物乳杆菌工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建敲除β-半乳糖苷酶编码基因lacA和lacLM的植物乳杆菌NZ0203；

(2)将带有启动子P_lac的纤维二糖2-差向异构酶的编码基因连接到表达载体pNZ8148上，将表达载体pNZ8148中的诱导型启动子P_nis替换为乳糖诱导型强启动子P_lac，得到重组质粒；

(3)将步骤(2)的重组质粒转化到步骤(1)的植物乳杆菌NZ0203中，筛选后即得转化乳糖生成乳果糖的植物乳杆菌工程菌株。