[发明专利]一种鸡胚原代肝细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种鸡胚原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，包括步骤如下：

步骤一：将孵化至12日龄的鸡胚经75％乙醇浸泡消毒后放入无菌操作台；

步骤二：无菌条件下取出步骤一中鸡胚，将鸡胚断头处理后置于含有4℃预冷的0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液中；

步骤三：对步骤二中处理后的鸡胚进行清理，将鸡胚表面的血液清洗掉；

步骤四：将步骤三清洗后的鸡胚放入无菌培养皿中，利用无菌眼科镊和眼科剪剖腹将肝脏取出，浸泡于4℃预冷的磷酸缓冲盐溶液中；

步骤五：将步骤四中肝脏剪成1mm³大小的小块后收集在50mL的离心管中；

步骤六：对离心管中肝脏碎块进行磷酸缓冲盐溶液清洗3次，每次1min；

步骤七：将磷酸缓冲盐溶液弃去后加入足够覆盖所有组织的胶原酶消化液，在37℃水浴锅中消化15min，整个过程持续摇晃以增加所有肝脏组织和胶原酶的接触；

步骤八：消化结束后用含10％胎牛血清的DMEM基础培养基终止消化；

步骤九：结束消化后，用5mL的移液枪将细胞吹打下来，分别经过200目和400目的细胞筛进行滤过；

步骤十：将细胞液收集后经100g离心5min；

步骤十一：使用DMEM培养液清洗细胞泥两次后使用适量的基础培养基重悬细胞，台盼蓝染色后，显微镜下计数；

步骤十二：用基础培养基将细胞密度调整至1×10⁶个/mL，然后接种于细胞培养板或培养瓶中；

步骤十三：所述细胞培养板或培养瓶置于温度为37℃、5％CO₂培养箱中培养，24h后再换液一次。

2.根据权利要求1所述的鸡胚原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤一中鸡胚采用旋转孵化箱进行孵化。

3.根据权利要求2所述的鸡胚原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，所述旋转孵化箱孵化过程中温度参数为37.5℃，湿度为70％。

4.根据权利要求1所述的鸡胚原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤七中胶原酶消化液预热处理到37℃。

5.根据权利要求1所述的鸡胚原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤八中DMEM基础培养基配方为：2mmol/L的L-谷氨酰胺、5μg/mL转铁蛋白、10^-7mol/L地塞米松、10^-7mol/L牛胰岛素、10mmol/L的HEPES缓冲液、1％双抗的DMEM基础培养液。

6.根据权利要求5所述的鸡胚原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，所述10mmol/L的HEPES缓冲液pH值为7.0。

7.根据权利要求1所述的鸡胚原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤十二中细胞培养板为6孔细胞板。