[发明专利]一种BCR-ABL基因融合检测的校准品和参考品的制备方法及其应用

说明书

本发明提供了一种BCR‑ABL基因融合检测的校准品和参考品的制备方法及其应用，方法包括：分别制备ABL野生型装甲RNA和BCR‑ABL融合型装甲RNA；使用保护稀释液分别对所述ABL野生型装甲RNA和BCR‑ABL融合型装甲RNA进行溶解；通过数字PCR对所述ABL野生型装甲RNA和BCR‑ABL融合型装甲RNA的浓度进行检测；使用保护稀释液对所述ABL野生型装甲RNA和BCR‑ABL融合型装甲RNA进行梯度稀释，得到校准品；将ABL野生型装甲RNA校准品和BCR‑ABL融合型装甲RNA校准品按比例混合，得到参考品。制得的校准品和参考品与WHO一级标准品溯源性好，结果准确。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种BCR-ABL基因融合检测的校准品和参考品的制备方法及其应用。

背景技术

慢性髓系白血病(CML)是一种以中晚幼粒细胞恶性增殖为特征的疾病，约90％～95％的CML患者中可检测到BCR-ABL融合基因(即9号染色体上的ABL基因易位到22号染色体上的BCR基因上形成融合基因)，可用于CML的分型诊断、疗效评价，以及作为微小残留病的检测和预后评估的可靠指标。

目前，临床常用检测方法包括常规染色体分析、荧光原位杂交(FISH)和荧光定量PCR。NCCN指南推荐CML患者达到CCyR(完全细胞学缓解)后应该每三个月进行一次BCR-ABL荧光定量PCR检测，用来监测残留白血病细胞有否上升、下降或处于稳定状态。

目前，BCR-ABL荧光定量PCR检测已国际标准化，考虑到实验的不同条件(如不同的参考基因、PCR引物、提取方法及荧光定量PCR体系、反转录体系等)的差异，各实验室的检测结果需和WHO一级标准品进行比对，并建立转换系数(CF)，从而将BCR-ABL的定量结果转换成国际标准值(IS)。

然而，WHO一级标准品货期漫长，手续繁多，且经过提取后获得的RNA量很少，不能满足企业的研发、验证及质检的需求。此外，现有技术往往不能与WHO一级参考品进行溯源，定量结果缺乏可靠性；或即使能溯源，但和理论值差异较大；或不同的参考品制备批次间存在较大的批间差异，不能保持良好的一致性。

因此，如何提供一种容易获取的校准品及参考品，可以用于试剂的研发、验证及质检中，已成为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种BCR-ABL基因融合检测的校准品和参考品的制备方法及其应用，制备得到的校准品和参考品具有良好的扩增效率，批间差异小，可以与WHO一级标准品进行很好的溯源，校正系数十分接近1.0(即检测值等同于理论值)，应用价值极高。

为达此目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种BCR-ABL基因融合检测的校准品和参考品的制备方法，所述制备方法包括：

分别制备ABL野生型装甲RNA和BCR-ABL融合型装甲RNA；

使用保护稀释液分别对所述ABL野生型装甲RNA和BCR-ABL融合型装甲RNA进行溶解；

通过数字PCR对所述ABL野生型装甲RNA和BCR-ABL融合型装甲RNA的浓度进行检测；

使用保护稀释液对所述ABL野生型装甲RNA和BCR-ABL融合型装甲RNA进行梯度稀释，得到校准品；将ABL野生型装甲RNA校准品和BCR-ABL融合型装甲RNA校准品按比例混合，得到参考品。

本发明中，选用装甲RNA用于制备校准品及参考品，可以与WHO一级标准品在核酸层面保持一致；加入保护稀释液，可以提高并稳定反应的扩增效率，减少或消除批间差异；选用数字PCR进行检测，对于装甲RNA的定量检测更准确；制备得到的校准品和参考品能够与WHO一级标准品进行很好的溯源，校正系数十分接近1.0。