[发明专利]一种变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株JSU01ΔkguE，其特征在于，以变形假单胞菌JSU01为基础菌株，敲除2-酮基葡萄糖酸差向异构酶的全部编码序列或部分编码序列。

2.根据权利要求1所述变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株JSU01ΔkguE，其特征在于，敲除的2-酮基葡萄糖酸差向异构酶的全部编码序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株JSU01ΔkguE，其特征在于，敲除的2-酮基葡萄糖酸差向异构酶的部分编码序列如SEQ ID NO:2所示。

4.权利要求1～3任意一项所述变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株JSU01ΔkguE的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以变形假单胞菌JSU01的基因组DNA为模板，用引物P1、引物P2进行PCR扩增，得到kguE基因的上游同源臂片段；

2)以变形假单胞菌JSU01的基因组DNA为模板，用引物P3、引物P4进行PCR扩增，得到kguE基因的下游同源臂片段；

3)以步骤1)中所述kguE基因的上游同源臂片段和步骤2)中所述kguE基因的下游同源臂片段为模板，用引物P1和P4进行重叠PCR扩增，得到融合片段ΔkguE；

4)将所述融合片段ΔkguE和质粒用BamH I和Hind III进行双酶切处理，得到双酶切产物进行连接，得到携带融合片段ΔkguE的重组载体；

5)将步骤4)中所述携带融合片段ΔkguE的重组载体转化到变形假单胞菌JSU01的感受态细胞中，得到重组菌株JSU01ΔkguE；

其中步骤1)与步骤2)之间没有时间顺序的限制。

5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤1)中引物P1的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示；引物P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

6.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤2)中引物P3的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示；引物P4的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

7.根据权利要求4～6任意一项所述构建方法，其特征在于，步骤5)中转化后，包括阳性菌株的筛选；

所述阳性菌株的筛选的方法是以转化后的菌株的基因组DNA为模板，采用引物P1和P4进行PCR扩增，PCR扩增产物为1594bp时表明转化后的菌株为缺失kguE基因的突变株JSU01ΔkguE。

8.权利要求1～3任意一项所述变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株JSU01ΔkguE或权利要求4～7任意一项所述构建方法构建得到的JSU01ΔkguE在2KGA发酵生产中的应用。

9.权利要求1～3任意一项所述变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株JSU01ΔkguE或权利要求4～7任意一项所述构建方法构建得到的JSU01ΔkguE在制备生产2KGA的发酵剂中的应用。

10.一种生产2KGA的发酵剂，其特征在于，包括权利要求1～3任意一项所述变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶缺失突变株JSU01ΔkguE或权利要求4～7任意一项所述构建方法构建得到的JSU01ΔkguE。