[发明专利]用于布氏杆菌的DETECTR核酸检测的试剂和试剂盒

说明书

本发明公开了用于布氏杆菌的DETECTR核酸检测的试剂和试剂盒。本发明所保护的用于检测布鲁氏菌的试剂盒含有omp2a‑F4/R3引物对、ssDNA reporter和crRNA。所述omp2a‑F4/R3引物对对应序列表中SEQ ID No.12和SEQ ID No.19所示的单链DNA分子，所述crRNA为序列表中SEQ ID No.26所示的RNA分子。实验证明，本发明所提供的用于检测布鲁氏菌的试剂盒对模拟样本(血液样本和牛奶样本)检测均有较好的灵敏度和特异性，灵敏度接近1拷贝数/μL(2拷贝数/反应)，并能特异检测布鲁氏菌，为布鲁氏菌的体外诊断提供了可用的快速检测方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于布氏杆菌的DETECTR核酸检测的试剂和试剂盒。

背景技术

布鲁氏菌(Brucella)属所引起的布鲁氏菌病是一种广泛的人畜共患病，主要感染牛、羊、猪及犬等，对畜牧业造成重大的损失。其中牛、羊和猪布鲁氏菌能够传染人类，以牛、羊布鲁氏菌最为常见，严重威胁人类的身体健康。作为生物安全防治的第一步，对引起公共卫生事件的源头进行快速的检测和鉴定至关重要。重组酶聚合酶介导的扩增技术(RPA)是近年兴起的一种恒温扩增技术，由于RPA扩增方式无需复杂的温度改变，适合用于现场快速检测。但是，其单级扩增反应的原理，与目前常用的实时定量PCR(q-PCR)方法比较，该技术方法的灵敏度很难有实质性的提升。近年报道的DNA内切酶靶向的CRISPR反式报告系统(DETECTR)中，其效应子Cas12a能够识别单链或双链DNA，与常用于体外检测的CRISPR-Cas13a相比，该效应子无需将底物转换成RNA而省去了反转录步骤。因此，基于RPA技术上的DETECTR系统用于细菌基因组DNA的核酸检测操作更加简便。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何制备快速检测布鲁氏菌核酸分子的试剂或试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测布鲁氏菌的试剂盒。所述试剂盒含有omp2a-F4/R3引物对、ssDNA reporter和crRNA。所述omp2a-F4/R3引物对由omp2a-F4引物和omp2a-R3引物组成。所述omp2a-F4引物为序列表中SEQ ID No.12所示的单链DNA分子。所述omp2a-R3引物为序列表中SEQ ID No.19所示的单链DNA分子。所述ssDNAreporter为序列表中SEQ ID No.29所示的单链DNA分子。所述crRNA为序列表中SEQ IDNo.26所示的RNA分子。

上文所述试剂盒中，所述ssDNA reporter在SEQ ID No.29的第1位核苷酸上可标记荧光基团、第12位核苷酸可标记淬灭基团BHQ1。所述荧光基团可为FAM。所述荧光基团还可选自FAM、VIC、HEX、TRT、CY3、CY5、ROX、JOE、FITC、TET、NED、TAMRA、LC RED460、LC RED705、Quasar705或Texas Red中的至少一种。

上文所述试剂盒还可含有Cas12a蛋白。所述Cas12a可为毛螺旋菌的Cas12a重组表达蛋白LbCas12a。

上文所述试剂盒还可包括含有核苷酸序列是SEQ ID No.28的omp2a基因序列的重组载体。所述重组载体可为重组T载体质粒pEASY-T1-omp2a。

上文所述试剂盒的使用方法可包括RPA反应步骤和CRISPR/Cas12a反应步骤。

上文所述RPA反应步骤可为使用上文所述的omp2a-F4引物和omp2a-R3引物对待测样品进行恒温扩增反应，得到RPA扩增产物。

上文所述CRISPR/Cas12a反应步骤可为使用上文所述的crRNA和上文所述的Cas12a蛋白对所述RPA扩增产物进行DNA内切酶靶向的CRISPR反式报告系统反应。