[发明专利]一种抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体的制备方法及其应用，所述抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体的制备方法包括如下步骤：1)抗原制备：提取银环蛇毒素，将银环蛇毒素进行灭活得到银环蛇毒素抗原；2)免疫马匹：将步骤一制得的所述银环蛇毒素抗原免疫马匹，收集所述马匹的血清；3)抗体提取：从步骤2)的血清中提取马IgG，经眼镜蛇毒素吸附，得到抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体。本发明制备了抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体，在此基础上研制了银环蛇毒素免疫层析检测试纸条，具有操作简单、不需要复杂仪器、灵敏度高和特异性好等优点，从而有效解决了银环蛇毒素的现场快速检测难题。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体的制备方法及其应用。

背景技术

蛇类在世界上分布极为广泛，其种属随地域、气候、环境而各异。在我国各省都有蛇的分布，但大部分蛇种集中于长江以南、西南各省，已知现有蛇类210种，有毒的占100种，其中陆地常见的主要毒蛇有9种，海生毒蛇2种。其中银环蛇被认为是我国最毒的毒蛇，该蛇全身体背有白环和黑环相间排列，白环较窄。这种蛇在中国分布很广泛，安徽、浙江、江苏、江西、福建、台湾、湖北、湖南、广东、广西、海南、贵州、云南等地都有分布。银环蛇咬伤在我国占各类毒蛇咬伤的8.2％，居第五位，但死亡率位居首位。

蛇毒是复杂的混合物。各种蛇类毒腺分泌的毒素含有很多结构不同、性质各异，且通常情况下对其他生物呈现毒性的化合物分子。这些蛇毒腺产生的含有特定生物学活性的化合物分子统称为蛇毒素。蛇毒的主要成分为大分子蛋白质(酶占蛋白质的50％)、小分子肽类和非酶类物质，是由许多结构相似的富含半胱氨酸的分泌型活性蛋白，以及氨基酸、核苷酸、游离的脂质、碳水化合物、生物碱、可结合蛋白的金属元素等组成的复杂混合物。蛇毒中蛋白质占75-90％，是具有活性和生物活性的主要成分，其分子量大多在6-30kDa之间，一般为10kDa。

蛇毒组分并非固定不变，即使是同一成分在不同的个体、种、属、科之间都具有不同的浓度和分布，这可能与蛇的种类、摄食和环境条件有关。不同蛇由于所含毒素不同，产生不同的效应。各种蛋白或肽类成分是致毒的主要因素。以银环蛇毒素为例，研究者采用鸟枪蛋白质组学策略结合无标记定量鉴定了银环蛇毒的蛋白质种类和丰度，筛选到了13种蛋白质，包括β－银环蛇毒素、短神经毒素同系物NTL4、金属蛋白酶(2种)、富含半胱氨酸的分泌蛋白、L－氨基酸氧化酶、乙酰胆碱酯酶、透明质酸酶、α珠蛋白、Thaicobrin、磷脂酶B81b，血红蛋白α亚基和血红蛋白β亚基。

毒蛇咬伤如不及时有效救治常致人死亡，及时精准诊断毒素种类和对症治疗是关键。由于蛇种间的亲缘关系以及蛇毒组分的种类和丰度复杂性，部分蛇毒蛋白在多种蛇毒中均存在，这部分蛇毒蛋白一旦被用做检测靶标，则可能因为交叉反应而影响诊断准确度。目前市场上还没有银环蛇毒素快速、灵敏、特异的检测试剂或产品。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种制备抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体的方法及其应用。

本发明提供一种抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

1)抗原制备：提取银环蛇毒素，将银环蛇毒素进行灭活得到银环蛇毒素抗原；

2)免疫马匹：将步骤一制得的所述银环蛇毒素抗原免疫马匹，收集所述马匹的血清；

3)抗体提取：从步骤2)的血清中提取马IgG，经眼镜蛇毒素吸附，得到抗银环蛇毒素特异性多克隆抗体。

其中，所述步骤1)中银环蛇毒素进行灭活的方法为将银环蛇毒素用碘乙酰胺处理进行灭活。

其中，所述步骤2)中免疫马匹的方法为将灭活银环蛇毒与积羊毛脂石蜡油佐剂混合后注射马匹，收集免疫马匹的血清。