[发明专利]一种马尾松胚乳二倍体愈伤组织诱导与增殖的方法

权利要求书

1.一种马尾松胚乳二倍体愈伤组织诱导与增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a）取成熟马尾松种子，剥去种壳后置于4℃冰箱过夜；

b）配置愈伤组织诱导培养基，加入培养基成分后溶于1L纯净水中，加热溶解调节ph值之后分装入组培瓶中，于121℃灭菌25min，冷却后取出备用；

c）在超净工作台中对去壳后的种子进行消毒灭菌，先使用酒精消毒，消毒后用无菌水冲洗3~5次，再使用NaClO消毒，之后无菌水冲洗3~5次；

d）将消毒后的种子用灭菌后的滤纸吸干表面水分，再纵切种胚取出，接种于配置好的愈伤组织诱导培养基中，置于25℃条件下暗培养2个月；

e）配置愈伤继代培养基，配置方式与步骤b)相同；

f）每隔一个月，将愈伤组织从诱导培养基中转接入继代培养基，转接时将愈伤组织切至黄豆大小，再转到光环境下培养；

g）对各次继代的愈伤组织进行染色体倍性鉴定，计算二倍体细胞的比例；

h）愈伤细胞染色体倍性稳定后，此时愈伤组织二倍体细胞比例高达86%，对愈伤组织进行增殖培养，将愈伤组织从继代培养基中转接入增殖培养基，转接时将愈伤组织切至黄豆大小。

2.如权利要求1所述的一种马尾松胚乳二倍体愈伤组织诱导与增殖的方法，其特征在于：所述步骤b)与e）中，培养基的成分配方为DCR+NAA2mg/L+6-BA1mg/L，配置方式为称取DCR培养基、蔗糖以及琼脂混合后溶解，溶解后加入生长素NAA2mg/L与细胞分裂素6-BA1mg/L，并定容至1L。

3.如权利要求1所述的一种马尾松胚乳二倍体愈伤组织诱导与增殖的方法，其特征在于：所述步骤c)中，酒精浓度为75%且消毒时间为30s，NaClO浓度为有效率浓度2%且消毒时间为15min。

4.如权利要求1所述的一种马尾松胚乳二倍体愈伤组织诱导与增殖的方法，其特征在于：所述步骤f）中，稳定倍性所需的转接次数为4次每次一个月，也就是4个月。

5.如权利要求1所述的一种马尾松胚乳二倍体愈伤组织诱导与增殖的方法，其特征在于：所述步骤h）中，培养基的成分配方为WPM+NAA0.05mg/L+MT0.5mg/L；配置方式为称取WPM培养基、蔗糖以及琼脂混合后溶解，溶解后加入生长素NAA0.05mg/L与细胞分裂素MT0.5mg/L，定容至1L。

6.如权利要求1所述的一种马尾松胚乳二倍体愈伤组织诱导与增殖的方法，其特征在于：所述愈伤诱导培养基和增殖培养基均加入蔗糖30g/L和琼脂7g/L，且ph值为5.5，其培养环境温度控制为25±1℃。