[发明专利]EHDV-2型单克隆抗体、制备源细胞株、产物应用及试剂盒

说明书

本发明涉及EHDV‑2型单克隆抗体、制备源细胞株、产物应用及试剂盒。本发明方法包括以下步骤：在杂交瘤细胞株EHD E2C5中提取流行性出血病病毒2型单克隆抗体，注射小鼠腹腔，取腹水纯化制备而得。本发明中的抗体检测试剂盒可用于流行性出血病病毒血清抗体的检测和流行病学调查，操作程序简单，检测结果、技术性能指标均等同于世界动物卫生组织(OIE)推荐的EHD ELISA抗体检测方法。

技术领域

本发明涉及病毒抗体检测领域，尤其涉及流行性出血病病毒2型单克隆抗体、制备源细胞株及其试剂盒。

背景技术

流行性出血病病毒2型简写EHDV-2型。EHD-2型属于EHD九种血清型中的一种。EHD不同的血清型毒株对牛的致病性差异较大。现有的研究认为仅EHDV-2型的其中1个毒株-茨城病病毒(Ibaraki virus，IBAV)对牛有较强致病性，其引起牛的突发高热、咽喉麻痹、关节疼痛性肿胀等症状。我国每年从国外进口10万-20万头种牛，加强EHDV-2型病毒抗体的监测，是保障我国种牛健康养殖的措施之一。

EHD抗体检测方法，现有中和试验(VN)、琼扩试验和ELISA检测方法，其中中和试验实验环境要求高，需要生物安全一定级别实验室进行，试验周期长3-5天；琼扩试验需要有经验的实验员观察判定，不能数字显示检测结果；ELISA方法，通过酶联免疫分析仪读取，结果以数字化形式判定，客观、准确，具有较强的使用优势。本专利研制的EHD-2型B-ELISA抗体检测方法，主要针对EHD感染牛致病性的毒株产生的抗体检测而设计，具有显著的针对性，对于EHD感染牛的防控意义较大，同时研制的试剂盒其检测灵敏性、特异性等指标均与OIE推荐的类似方法相近。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，利用制备的EHD-2型单克隆抗体、EHD-2型病毒包被的ELISA板，组装试剂盒，试剂盒检测指标达到国际认可的检测值。

本发明解决上述技术问题的技术方案是，一种制备流行性出血病病毒2型单克隆抗体的细胞株，该细胞株：杂交瘤细胞株EHD E2C5，保藏时间：2021年8月12日，保藏编号：CCTCC NO:C2021180，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地点：中华人民共和国湖北省武汉市武汉大学保藏中心。

使用上述的细胞株制备流行性出血病病毒2型单克隆抗体的方法，该方法包括以下步骤：在杂交瘤细胞株EHD E2C5中提取流行性出血病病毒2型单克隆抗体，注射小鼠腹腔，取腹水纯化制备而得。

上述的方法，包括以下步骤：

(1)用纯化的EHDV-2型灭活病毒，分别加等体积弗氏完全佐剂(FCA)乳化和弗氏不完全佐剂(FIA)乳化，先后免疫BALB/c小鼠(Balb/c小鼠)三次；

(2)取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇(MW1500)融合剂下融合，HAT培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法检测分泌抗EHDV-2病毒的阳性孔；用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆，获得能稳定传代并分泌抗EHDV-2病毒蛋白的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株EHD E2C5。

上述方法制备产物的应用，所述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体针对口蹄疫A型或Asia I型或蓝舌病或赤羽病或病毒性腹泻无任何免疫反应。

上述方法制备产物的应用，所述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体仅针对EHDV-2病毒的抗原决定簇

上述方法制备产物的应用，所述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体仅与EHDV-2病毒及EHD抗原有特异性免疫反应。

一种抗体试剂盒，所述的试剂盒包括如上述的流行性出血病病毒2型单克隆抗体。

上述述的抗体试剂盒，所述的试剂盒还包括流行性出血病病毒2型抗原预包被板、强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照、HRP羊抗鼠二抗、20倍浓缩洗涤液、稀释液、底物液以及终止液。