[发明专利]一种猫粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

一种猫粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用，涉及生物基因工程领域。该重组融合蛋白由猫粒细胞集落刺激因子突变体与蓖麻毒素B链截短肽经柔性linker连接而形成。制备方法为：猫粒细胞集落刺激因子突变表达载体构建；大肠杆菌重组表达载体构建；重组FeG‑CSF‑Mut/RTBD1融合蛋白表达；重组FeG‑CSF‑Mut/RTBD1融合蛋白纯化与复性。本发明将猫G‑CSF突变体与蓖麻毒素B链截短肽连接获得长效粒细胞集落刺激因子，可增强粒细胞集落刺激因子的生物学活性，提高粒细胞集落刺激因子在体内血液中的蛋白稳定性，进而提高在机体内药物的半衰期。该重组融合蛋白具有治疗白细胞减少症的功能。

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，具体涉及一种猫粒细胞集落刺激因子 突变体重组融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种糖蛋白，主要作用于中性粒细胞系(lineage)造血细胞的增殖、分化和活化。重组猫粒细胞集落刺激因子 (rFeG-CSF-Mut/RTBD1)作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用 是刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细 胞及噬酸性细胞的多种功能。G-CSF临床主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗 后引起的白细胞减少症、治疗骨髓造血机能障碍及骨髓增生异常综合征、预防 白细胞减少可能潜在的感染并发症、以及使感染引起的中性粒细胞减少的恢复 加快。但是，粒细胞集落刺激因子在临床中存在半衰期短、体内易降解等难题， 限制了粒细胞集落刺激因子的临床应用。

蓖麻毒素(Ricin toxin，RT)由RTA和RTB两个肽链以二硫键共价连接。 其中RTB由262个氨基酸组成。RTB单独存在时没有毒性，且具有增强机体免 疫反应的功能。RTB是一个两叶形结构的分子，由不同的两个球形区域构成相 同的折叠拓扑结构，每一个区域又包括三个亚区(α，β，γ)，只有1α和2β有明 显的半乳糖结合活性。

目前，将猫G-CSF突变体与蓖麻毒素B链截短肽组成重组融合蛋白来提高 重组融合蛋白治疗白细胞减少症的活性及延长重组融合蛋白半衰期的研究还未 见报道。

发明内容

本发明提供一种猫粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白及其制备方法 和应用，以提高重组融合蛋白治疗白细胞减少症的活性，延长重组融合蛋白半 衰期，提高白细胞减少症的治疗效果。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的一种猫粒细胞集落刺激因子突变体重组融合蛋白，该重组融合蛋 白由猫粒细胞集落刺激因子突变体与蓖麻毒素B链截短肽经柔性linker连接而 形成。

作为优选的实施方式，所述猫粒细胞集落刺激因子突变体的制备过程如下： 设计定点突变引物，以重组质粒pUC57-FeG-CSF为模板，将猫粒细胞集落刺激 因子序列中第28位天冬氨酸突变为精氨酸，第121位谷氨酰胺突变为苯丙氨酸， 将突变后的序列命名为FeG-CSF-Mut；

所述定点突变引物的序列如下：

SiteⅠ

Forward：5'-GTAAGGTCCAAGCTAGAGGCACAGCCCTGCAG-3'；

Reverse：5'-CTGCAGGGCTGTGCCTCTAGCTTGGACCTTAC-3'；

SiteⅡ

Forward：5'-GCAATTAATATCTGGCAGTTCATGGAGGATGTGGGTATGG- 3'；

Reverse：5'CCATACCCACATCCTCCATGAACTGCCAGATATTAATTGC-3'。