[发明专利]一种定向合成右旋糖酐的融合酶及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种可定向合成右旋糖酐的融合酶大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于：以P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶基因和链球菌来源的右旋糖酐酶基因为模板，以(EAAAK)_n(n＝0,1,2)为连接肽将两个酶基因按顺序进行同源重组并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到可以定向合成不同低分子量右旋糖酐的融合酶大肠杆菌工程菌BL21(DE3)/dex-YG-nG-a1dex(n＝0,1,2)。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于：大肠杆菌工程菌BL21(DE3)/dex-YG-G-a1dex保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为定向合成低分子量右旋糖酐融合酶大肠杆菌BL21(DE3)，保藏日期为2021年07月08日，保藏编号为CGMCCNo.22849。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：以(EAAAK)_n(n＝0,1,2)为连接肽，进行分子模拟，引物设计、重组质粒构建和宿主菌转化。

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，以(EAAAK)_n(n＝0,1,2)为连接肽，进行分子模拟的具体步骤如下，将P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶蛋白和链球菌来源的右旋糖酐酶通过Discovery Studio 2019软件进行序列相似性比对搜索模板，将模板进行结构比对叠合，将目标序列与模板序列比对产生融合酶模型。

5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述引物设计是根据P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶基因和载体pET-28a-(+)以及链球菌来源右旋糖酐酶序列，借助SnapGene软件设计突变引物如下：

n＝0时，

pET-28a-(+)-P473S/P856S模板：

上游引物：

5’-----GGTTACTTTGCTCCATTGCTGACACAGCATTTCCATTATTATC-----3’

下游引物：

5’-----AGAACGACCTCGAGCACCACCACCACCACTGA-----3’；

a1dex模板：

上游引物：

5’-----GTGTCAGCAATGGAGCAAAGTAACCGCCAG-----3’

下游引物：

5’-----GCTCGAGGTCGTTCTTACGGCCTTTGATCAG-----3’；

n＝1时，

pET-28a-(+)-P473S/P856S模板：

上游引物：

5’-----TTTCGCGGCGGCTTCTGCTGACACAGCATTTCCATTATTATCAAAT-----3’

下游引物：

5’-----TAAGAACGACCTCGAGCACCACCACCACCACCACTG-----3’；

a1dex模板：

上游引物：

5’-----CAGCAGAAGCGGCCGCGAAAATGGAGCAAAGTAACCGCCAG-----3’

下游引物：

5’-----GCTCGAGGTCGTTCTTACGGCCTTTGATCAG-----3’；

n＝2时，

pET-28a-(+)-P473S/P856S模板：

上游引物：

5’-----GGCCGCTTCTTTCGCGGCCGCTTCTGCTGACACAGCATTTCCATTATTATCAAAT-----3’

下游引物：

5’-----AGAACGACCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAAC-----3’；

a1dex模板：

上游引物：

5’-----GCCGCGAAAGAAGCGGCCGCGAAAATGGAGCAAAGTAACCGCCAG-----3’

下游引物：

5’-----GCTCGAGGTCGTTCTTACGGCCTTTGATCAG-----3’。