[发明专利]高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其编码DNA及其在NGS中的应用

说明书

本发明提供一种高保真Pfu DNA聚合酶突变体，其特征为，在野生型Pfu DNA聚合酶的基础上，进行1个、3个或6个氨基酸位点的突变，其中突变位点在以下位点中选择：Y403A、P411H、V438K、A741S、R757Q、S768K。并公开了其编码DNA，以及其在NGS中的应用。本发明的高保真Pfu DNA聚合酶突变体，具有超高保真性和高扩增效率，可稳定高效的应用于二代测序中文库富集过程，有效提高文库测序质量，减少碱基错配率，可用于遗传信息的精准分析和判读。

技术领域

本发明专利涉及一种高保真Pfu DNA聚合酶突变体及其编码DNA，以及其在NGS中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

高通量测序（High-Throughput Sequencing）又称为下一代测序（NextGeneration Sequencing，NGS），测序通量大，一次即可测定几十到几百万条DNA分子序列，是对传统测序技术革命性的改变。目前NGS技术已应用到生命科学领域的方方面面，解决了越来越多的生物学问题。随着测序技术的广泛普及和应用，市场对建库试剂盒的需求也日益增加，与此同时，人们对建库试剂盒的质量标准也提出了更高的要求，不再把文库产量放在第一位，更多的开始关注质量，而众多质量指标中，保真性首当其冲。尤其对于临床检测领域，保真性至关重要，只有保证测序信息的真实性，才能做出更精准的判断。

文库制备过程中，聚合酶链式反应（PCR）是重要的一步，可大量富集目标文库，保证足够的文库产出，对于PCR free建库，则省略了该步骤，即不会通过扩增过程引入突变，但由于样本质量的限制，大部分样本种类依然需要PCR扩增过程。因此，需要得到一个保真性好，扩增效率高的高保真酶。

Pfu DNA聚合酶( Pfu DNA polymerase )，又称Pfu聚合酶，或Pfu酶，是在嗜热的古核生物火球菌属内发现的，一类能在活体内进行DNA复制的酶，该酶含有2个蛋白亚基(P45和P50)，为多聚体，分子量约为90kDa，该酶同时具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切核酸酶活性。在聚合反应中可纠正错误掺入的碱基，保真性是极高的，碱基错误率约为2×10^-6。体外PCR实验中，使用Pfu聚合酶可以高保真的扩增DNA片段。然而Pfu酶扩增效率低，影响了Pfu酶的应用推广。现阶段NGS技术的不断发展和多领域应用，人们也不再止步于Pfu酶的保真性，对DNA聚合酶的保真性提出了更高的要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种高保真Pfu DNA聚合酶突变体，扩增效率高，保真性强。

该发明对野生型Pfu DNA聚合酶进行突变改造，同时对相应位点进行突变，成功筛选得到了13个突变体，其中有6个单位点突变体，6个三位点突变体，1个六位点突变体，该13个突变体在保真性以及扩增效率方面均有不同程度的改善，具体突变信息见下表，其中六位点突变体性能改善最佳，突变位点为Y403A，P411H，V438K，A741S，R757Q，S768K。

单位点突变

三位点突变

六位点突变

本发明还公开了上述的高保真Pfu DNA聚合酶六位点突变体的氨基酸序列，如SEQID NO：1所示，该高保真DNA聚合酶六位点突变体的编码DNA，其序列如SEQ ID NO：2所示。

上述的高保真Pfu DNA聚合酶突变体在NGS中的应用。

本发明的高保真Pfu DNA聚合酶突变体，具有超高保真性和高扩增效率，可稳定高效的应用于二代测序中文库富集过程，有效提高文库测序质量，减少碱基错配率，用于遗传信息的精准分析和判读。

本发明的有益效果为：