[发明专利]烟酰胺高效率转化为烟酸的菌种的方法

权利要求书

1.烟酰胺高效率转化为烟酸的菌种的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S100：烟酰胺菌的筛选与鉴定；

S200：生物催化反应条件探究；

S300：催化反应条件确定及小试放大实验验证。

2.如权利要求1所述的烟酰胺高效率转化为烟酸的菌种的方法，其特征在于，S100的步骤如下：

S101：取3-氰车间废水，经富集筛选后获得可以将烟酰胺转化为烟酸的菌种；

S102：按照无菌操作的要求，将己筛选出的优势菌种接种于加富培养基斜面上30℃培养3天后取出，菌种生长，有菌落长出，再次将长出菌落进行扩大培养30℃培养3天后观察，效果较好，置于4℃冰箱保存；

S103：平板活化：取保藏的烟酰胺菌于K+抗性的LB平板上稀释涂布，37℃恒温培养箱中培养16h；

S104：转种子液：取出平板，挑取50个单克隆菌落转接于50支K+抗性的LB单管中，于37℃摇床220rpm培养16h；

S105：转发酵液：将培养后的单管取出，分别吸取1.5ml菌液接种于50个K+抗性的摇瓶中，37℃摇床220rpm培养约1.5h，观察到培养后的菌液呈絮状时，取出，加入诱导剂IPTG，于18℃摇床中220rpm培养22h；

S106：测酶活：将发酵液取出，通过HPLC法测量每瓶中的烟酰胺酶活、同时测量OD600值，HPLC检测参数如下：色谱柱：Aglient C18(4.6mm*250mm,5ul)、流速0.8ml/min、柱温30℃、流动相A：水+庚烷磺酸钠+三乙胺+冰乙酸＝80mL+0.1g+0.02mL+0.1mL；流动相：90％流动相A+10％乙腈，底物溶液：100ul 70g/L烟酰胺溶液+690ul pH 7.0、0.05mol/l磷酸盐缓冲溶液；

S107：将底物溶液放置在控温30℃混匀振荡器上进行振荡，向其加入10ul处理后的发酵液，反应10min后加入200ul 0.5mol/L的硫酸溶液终止反应，将反应后的溶液放置在12000；rpm的离心机上离心3min；

S108：取离心后的反应液上清液稀释6倍上样；

S109：计算：计算与结果。

3.如权利要求2所述的烟酰胺高效率转化为烟酸的菌种的方法，其特征在于，S109的计算公式：

粗酶液酶活(U/mL)＝C×V×X/123.1/T/v

c—液相色谱得出的烟酸浓度，μg/mL；

V—反应体积，这里是800μL反应液+200μL硫酸试液；

X—反应进样前的稀释倍数(6)；

T—反应时间，10min；

v—所加粗酶液体积，10μL

123.1—烟酸分子量，g/moL；

发酵液酶活(U/mL)＝粗酶液酶活×发酵液稀释倍数(N)。

4.如权利要求1所述的烟酰胺高效率转化为烟酸的菌种的方法，其特征在于，S200的步骤如下：

S201：最适底物浓度：设置底物为10％、20％、30％、40％烟酰胺浓度梯度，在温度25℃、pH 7.55、酶添加量为4.8U/ml条件下反应，一定时间(10h)后统计底物与酶促反应速率之间的关系，确定最适底物浓度；

S202：最优酶量：设置酶用量为6.0U/ml、7.2U/ml、8.4U/ml、9.6U/ml、10.8U/ml浓度梯度，在底物浓度为20％烟酰胺、温度25℃、pH 7.55条件下反应，一定时间后统计酶用量与烟酰胺转化率之间的关系，确定最优酶量；

S203：最适温度：设置25℃、30℃、35℃、40℃、45℃温度梯度，在底物浓度为20％烟酰胺、pH7.55、酶添加量为8.4U/ml条件下反应，一定时间(6h)后统计温度与酶促反应速率之间的关系，确定最适温度；

S204：最适pH：设置pH为5.0-9.0，每隔1.0一个梯度，在底物浓度为20％烟酰胺、温度为36-38℃、酶添加量为8.4U/ml条件下反应，一定时间(6h)后统计pH与酶促反应速率之间的关系，确定最适pH。

5.如权利要求1所述的烟酰胺高效率转化为烟酸的菌种的方法，其特征在于，S300的步骤如下：

S301：确定烟酰胺催化反应小试(2L)实验方案：20％烟酰胺溶液，加入6.6U/ml的烟酰胺酶，在36-38℃条件下进行反应，全程pH控制在7.4±0.2左右，反应过程每隔半小时监测烟酰胺和烟酸含量变化；

S302：催化实验小试放大实验验证：20％烟酰胺溶液，加入6.6U/ml的烟酰胺酶，在36-38℃条件下进行反应，全程pH控制在7.4±0.2左右，反应过程反应过程每隔半小时监测烟酰胺和烟酸含量变化。