[发明专利]猪源性抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达单链抗体及其制备方法和用途

说明书

一种猪源性抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达单链抗体及其制备方法和用途，该真核表达单链抗体包含猪源单链抗体片段VH‑Linker‑VL，其中：猪抗体重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，猪抗体轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，Linker为中间连接肽。能够与猪流行性腹泻病毒N蛋白特异性结合，可抑制猪流行性腹泻病毒在宿主细胞内的复制，能够用于制备防治猪流行性腹泻药物的研究。

技术领域

本发明涉及的是一种基因工程领域的技术，具体是一种猪源性抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达单链抗体及其制备方法和用途。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)感染猪引起的临床表现为腹泻、呕吐、脱水甚至死亡的一种肠道疾病。PED的传染性强，发病率高，感染后的新生仔猪的死亡率甚至高达100％，该病在全球多个国家均有爆发，造成巨大的经济损失，影响全世界养猪产业的发展。疫苗接种是预防病毒性疾病的一种有效方法，但是由于PEDV的变异速度快，商业化疫苗对变异毒株的预防效果并不理想。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种猪源性抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达单链抗体及其制备方法和用途，能够与猪流行性腹泻病毒N蛋白特异性结合，可抑制猪流行性腹泻病毒在宿主细胞内的复制，能够用于制备防治猪流行性腹泻药物的研究。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种真核表达单链抗体，包含猪源单链抗体片段VH-Linker-VL，其中：猪抗体重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，猪抗体轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，Linker为中间连接肽。

所述的中间连接肽的核苷酸序列，如SEQ ID No.3所示。

本发明涉及上述单链抗体的实现方法，通过将猪源单链抗体片段VH-Linker-VL的编码基因插入真核表达质粒pCMV-HA，构建成为重组真核表达质粒pCMV-HA-scFv，将pCMV-HA-scFv转染Vero-E6细胞。

所述的真核表达单链抗体，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

所述的单链抗体的分子量大小约为28kDa。

本发明涉及上述单链抗体的应用，将其用于在猪流行性腹泻病毒感染的细胞中表达，以抑制猪流行性腹泻病毒的复制。

所述的抑制，P0.001，具有一定的抵抗猪流行性腹泻病毒感染的作用。

所述的应用，具体包括：

1)采用RT-PCR直接从重组表达的猪流行性腹泻病毒N蛋白免疫的猪脾脏组织RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区VH基因和轻链可变区VL基因；

2)利用SOE-PCR法将步骤1)得到的VH基因、中间连接肽和步骤1)得到的VL基因相连构建猪源性单链抗体基因；

3)将步骤2)获得的猪源性单链抗体基因克隆到原核表达载体pOPE101-XP中，构建重组质粒pOPE101-XP-scFv；

4)将步骤3)的重组质粒pOPE101-XP-scFv转化入E.coli JM109感受态细胞，经过多次转化，获得猪源性单链抗体库；

5)从步骤4)构建的猪源性单链抗体库中随机挑取单克隆，制备周质腔蛋白，以猪流行性腹泻病毒N蛋白作为包被抗原进行ELISA筛选，有阳性反应的相对应的阳性克隆即含有抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达单链抗体。

技术效果