[发明专利]基于CRISPR/CasRx的基因编辑方法及其应用

权利要求书

1.一种靶向Tmc1突变体的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种靶向Tmc1突变体的荧光报告载体，其特征在于，包含权利要求1所述的sgRNA序列。

3.一种靶向Tmc1突变体的荧光报告载体，其特征在于，包含权利要求1所述的sgRNA序列和AAV载体。

4.根据权利要求3所述的靶向Tmc1突变体的表达载体，其特征在于，所述AAV载体为AAV-PHP.eB。

5.一种如权利要求2-4任一项所述的靶向Tmc1突变体的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建人源密码子优化的CasRx基因表达质粒；

(2)构建sgRNA表达质粒；

(3)构建mCherry-Tmc1包含突变基因的荧光表达质粒。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)构建人密码子优化的CasRx基因表达质粒：先合成CasRx基因，并连接两个核定位信号肽，构建到哺乳动物表达载体中并由CAG启动子引导表达；

(2)构建sgRNA表达质粒：先合成两条互补单链sgRNA寡核苷酸，两条单链sgRNA退火形成双链，利用BspQI酶切位点将双链sgRNA连接到克隆骨架上，并由骨架上U6启动子表达；

(3)构建mCherry-Tmc1包含突变基因的荧光表达质粒：先合成一段90bp包含c.1234TA突变位点的序列，在序列的3’端连接mCherry荧光基因，构建到表达载体中，由CMV启动子表达。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述退火的温度为55℃。

8.一种靶向Tmc1突变体的CRISPR-CasRx系统，其特征在于，包含权利要求1所述的sgRNA序列和编码CasRx蛋白的基因序列。

9.一种靶向Tmc1突变体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括表达CasRx蛋白和权利要求3所述的表达载体。

10.权利要求1所述的靶向Tmc1突变体的sgRNA的用途，其特征在于，包括在制备成用于治疗遗传性耳聋的免疫细胞药物的应用。