[发明专利]一种高产番茄红素的沼泽红假单胞菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.高产番茄红素的沼泽红假单胞菌的构建方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

（1）扩增crtC基因片段的上下游同源臂，并将所述上下游同源臂连接起来，得到的产物与自杀质粒pJQ200SK分别进行酶切、连接、转化到感受态细胞中，得到重组质粒pJQ200SK-△crtC；所述crtC基因片段以及其上下游各1000 bp的序列如SEQ ID NO.1所示；所述crtC基因片段的上下游同源臂的连接片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；（2）将阳性重组质粒pJQ200SK-△crtC转化至野生型沼泽红假单胞菌中，经抗性筛选、测序验证后，得到工程菌株△crtC；

（3）扩增启动子PcbbG，将扩增产物与质粒pMG103进行无缝连接，转化至感受态细胞，得到重组质粒pMG103-PcbbG；所述启动子PcbbG的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

（4）扩增操纵子MVAzp，将扩增产物与重组质粒pMG103-PcbbG进行无缝连接，转化至感受态细胞，得到重组质粒pMG103-PcbbG-MVAzp；所述操纵子MVAzp的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示；

（5）将阳性重组质粒pMG103-PcbbG-MVAzp转化至工程菌株△crtC中，经抗性筛选、测序验证后，得到工程菌株△crtC/pMG103-PcbbG-MVAzp，即为所述的高产番茄红素的沼泽红假单胞菌。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述抗性筛选的步骤为：将转化后的菌株30℃培养，长出的单菌落划线在含有庆大霉素的抗性平板上继续培养，再从抗性平板上挑6个单菌落划线在两个不含庆大霉素抗性却含10%蔗糖的平板上，每个平板分三个区域；从不含庆大霉素的10%蔗糖平板上再选多个单菌落，分别在不含庆大霉素抗性的10%蔗糖平板和含庆大霉素抗性的10%蔗糖平板上划线，若后者有菌落，前者没有，则菌株通过抗性筛选。

3.权利要求1或者2所述的构建方法构建得到的沼泽红假单胞菌在用于生产番茄红素和/或提高番茄红素含量中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述沼泽红假单胞菌的使用方法为：

（1）挑取沼泽红假单胞菌的单克隆到培养基中，加入碳源和抗生素，30°C培养，获得种子液；

（2）将种子液按5%-10%的接种量转接至培养基中，加入碳源，30°C培养，测定OD在660nm处的吸光光度值，直到OD不再变化，离心收集菌体；

（3）向菌体中加入提取剂，放置在培养仪中震荡，每隔5min -10min用针尖戳碎沉淀，直至细胞沉淀变白色；离心，取上清，过滤后的液体中含有番茄红素，再利用HPLC检测番茄红素的产量。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述HPLC检测番茄红素产量的条件为：HPLC系统采用Thermo Ultimate 3000高效液相，色谱柱为4.6 x 250 mm，5 μm的 ZORBAXEclipse Plus C₁₈柱，检测器为UV检测器；柱温箱温度25 ℃；检测器波长为475 ℃；流动相为A：85%甲醇，B：15%乙酸乙酯；进样体积10 μL，流动相流速：1ml/min；流动相程序为：85%甲醇，15%乙酸乙酯，持续30min。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述碳源包括醋酸钠、苹果酸钠、琥珀酸钠、苯甲酸钠、甘油、NaHCO₃和CO₂中的至少一种，其浓度为20 mM。