[发明专利]含有AIF1细胞因子抗体的小球藻及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种含有AIF1细胞因子抗体的小球藻。

2.权利要求1所述含有AIF1细胞因子抗体的小球藻的制备方法，采用纯化出来的近江牡蛎AIF1细胞因子抗体蛋白制品标记FITC荧光标记，以pVEC穿膜肽为载体将AIF1细胞因子抗体蛋白分子导入小球藻，在室温黑暗条件下，进行AIF1细胞因子抗体孵育小球藻，从而获得含有AIF1细胞因子抗体的小球藻。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于：AIF1细胞因子抗体的制备包括如下步骤：

1)以近江牡蛎血淋巴细胞总RNA为模板，反转录成一链cDNA，克隆获得AIF1基因的编码框核苷酸序列；

2)将AIF1基因编码框的序列片段克隆到pMD19-T载体中，再经限制性内切酶酶切，与经同样酶切的pET-32(a)原核表达载体连接，获得重组表达质粒pET-32(a)-AIF1；

3)将阳性重组质粒PET-32(a)-AIF1转化到表达宿主菌E.coli Rossetta(DE3)，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测；

4)将阳性表达菌液扩大培养，利用蛋白质纯化试剂盒分离纯化重组蛋白质；

5)将纯化的AIF1蛋白多点注射新西兰大白兔，制备纯化多克隆抗体。

4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于：AIF1细胞因子抗体蛋白分子导入小球藻包括如下步骤：

1)AIF1细胞因子抗体纯化及绿色荧光标记

采用Protein A Sepharose亲和层析柱纯化获得抗血清的总IgG；使用NHS-Fluorescein(Pierce，美国)标记纯化的AIF1多克隆抗体；

2)小球藻培养及生长曲线绘制

小球藻采用f/2培养液进行传代培养，将无菌小球藻按照1：10比例接种到新鲜培养基中，培养条件：温度23℃，光照强度3000lx，光暗周期比为12h：12h。每隔24h无菌条件下取藻样于酶标仪上测定660nm处吸光值，绘制小球藻生长曲线，每个时间点执行3个生物学重复；

3)AIF1细胞因子抗体导入小球藻

收集处于对数生长期的小球藻并离心(400×g，10min)，使用无菌PBS

洗涤小球藻3次，使用细胞计数板显微镜下计数将浓度调整为10⁶cell/mL，离心去掉上清液；将100μl终浓度为100μg/ml AIF1抗体与终浓度为20μM pVEC混合后加入藻沉淀中，使其浓度为10⁶cell/mL；室温暗室中孵育，分别在孵育15min，30min时取样置于载玻片上，50％甘油封片于共聚焦显微镜下观察拍照，每个实验设置3个生物学重复。

5.根据权利要求2-4任一所述制备方法，其特征在于：采用激光共聚焦显微镜检测、验证小球藻体内含有牡蛎AIF1细胞因子抗体蛋白质成分及其含量。

6.权利要求1所述含有AIF1细胞因子抗体的小球藻用于制备鱼虾病害抗感染防治的免疫抗病饵料的应用。

7.根据权利要求6所述应用，所述应用为制备抗革兰氏阴性菌和类立克次氏体(RLO)感染的免疫饵料。

8.一种饵料，其特征在于：含有权利要求1所述含有AIF1细胞因子抗体的小球藻。