[发明专利]一种油茶叶肉原生质体分离与纯化方法

权利要求书

1.一种油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)对油茶组培苗进行22～32h黑暗预处理，采集油茶组培苗完全展开的叶片；

(2)去掉步骤(1)采集的叶片的主脉和叶缘，切成叶条加入到含EME培养基的无菌瓶中，盖上封瓶膜，负压下抽真空10min～1h；然后吸出EME培养基、加入酶液；无菌瓶用封口膜封口后酶解6～14h；

所述的酶液与EME培养基的pH调为5.5～6.0；其中，酶液：10～15g/L纤维素酶R-10、5～10g/L离析酶R-10、2.5～5g/L蜗牛酶、0.6g/L MES、1.8g/L二水合氯化钙、0.055g/L二水合磷酸二氢钠、27.325～54.62/L甘露醇、51.345～102.69g/L蔗糖、1/2MS培养基、250mg/LME；EME培养基：MS培养基+500mg/L ME+102.69～205.38g/L蔗糖；

(3)将步骤(2)酶解后的溶液通过无菌筛过滤，滤液离心后去上清，用W缓冲液对原生质体进行清洗和重悬，冰上静置待原生质体沉淀后，吸去上清，得到纯净的原生质体；

其中，W缓冲溶液：2mmol/L MES、125mmol/L CaCl₂、5mmol/L KCl、154mmol/L NaCl、5mmol/L葡萄糖，用1mol/L的HCl和KOH调pH为5.6～6.0。

2.根据权利要求1所述的油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，其特征在于：步骤(1)中，油茶组培苗黑暗预处理的时间为24h。

3.根据权利要求1所述的油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，其特征在于：步骤(2)中，负压下抽真空的时间为20min。

4.根据权利要求1所述的油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的酶液中纤维素酶R-10、离析酶R-10、蜗牛酶的浓度分别为15g/L、5g/L、2.5g/L。

5.根据权利要求1所述的油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的酶液中甘露醇的浓度为36.43g/L、蔗糖的浓度为68.46g/L，所述的EME培养基中蔗糖的浓度为136.92g/L。

6.根据权利要求1所述的油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的酶解在26～30℃的黑暗条件下进行。

7.根据权利要求1所述的油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的酶解的时间为10h。

8.根据权利要求1所述的油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的无菌筛的孔径为200目，所述的离心的条件为100～400r/min离心2～6min，所述的冰上静置的时间为10～20min。

9.根据权利要求1所述的油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)对油茶组培苗进行22～32h黑暗预处理，采集油茶组培苗完全展开的第一片叶片；

(2)去掉步骤(1)采集的叶片的主脉和叶缘，切成0.5～1mm宽的叶条，放入含10ml EME培养基的无菌小瓶中，盖上封瓶膜，负0.07MPa条件下抽真空10min～1h；然后吸出EME培养基，加入10ml的酶液；无菌小瓶用封口膜封口后在30～50rpm、26～30℃的黑暗条件下酶解6～14h；

(3)将步骤(2)酶解后的溶液通过200目无菌筛过滤，除去未酶解的叶片以及杂质，收集滤液于离心管；滤液于200～400r/min离心3～6min，去除上清液，轻缓地加入4ml W缓冲液悬浮原生质体，100～300r/min离心2～4min，收集滤液，重复清洗一次，弃掉上清液，加入1ml W缓冲液，冰上静止10～20min，吸去上清，加入等体积MMg缓冲液后得到纯净的原生质体。

10.根据权利要求9所述的油茶叶肉原生质体分离与纯化的方法，其特征在于：步骤(2)中，负0.07MPa条件下抽真空的时间为20min；酶液中纤维素酶R-10、离析酶R-10、蜗牛酶的浓度分别为15g/L、5g/L、2.5g/L；酶液中甘露醇的浓度为36.43g/L、蔗糖的浓度为68.46g/L，EME培养基中蔗糖的浓度为136.92g/L；酶解的时间为10h。