[发明专利]一种利用多种标志物联合检测外泌体的方法及试剂盒

说明书

本发明涉及肿瘤来源的外泌体检测技术领域，具体涉及一种利用多种标志物联合检测外泌体方法及试剂盒，该试剂盒包括用于捕获外泌体的捕获探针、邻近探针P1和P2以及信号探针S，P1包含第一核酸适配体序列以及有荧光素标记的序列，P2包含第二核酸适配体序列以及有荧光素标记的序列，信号探针S由Sa和Sb组成，Sa包含与有荧光素标记的序列互补的序列，Sb包含与Sa互补的序列以及有罗丹明标记的序列。该试剂盒，利用邻近杂交介导荧光共振能量转移实现外泌体表面多种标志物联合检测，以期为提高肿瘤早期诊断的准确度提供检测方法。

技术领域

本发明属于外泌体检测技术领域，具体涉及一种利用多种标志物联合检测外泌体的方法及试剂盒。

背景技术

肺癌是全球范围内的重大公共卫生问题，2020年全球肺癌发病率和死亡率分别为28.3/10万人和23.0/10万人，是死亡率最高的癌症。肺癌早期诊断并规范治疗可将不足20％的五年生存率提高到70％～80％。发展灵敏度高、特异性强的非创伤性诊断方法对肺癌早期诊断具有重要意义。“液体活检”可通过反复采样检测肿瘤生物标志物随时间推移的变化，在肿瘤早期诊断中具有创伤性小、标本易获得等优势，而生物标志物的选择是决定液体活检结果准确度的关键。

外泌体(Exosome,Exo)是由活细胞主动分泌的粒径为30nm～150nm的细胞外囊泡，介导细胞间的通讯，与肺癌的发生发展、血管生成和转移过程密切相关。Exo作为液体活检的检测目标之一，与循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA相比具有以下特点：Exo由肿瘤细胞主动分泌，在一定程度上与肿瘤细胞数量和活性水平相关；Exo表面蛋白具有细胞来源特异性，可反映肿瘤类型及进展情况；作为细胞间通讯的有效介体，其分泌、转运和消除均具有一定的时效性。因此，Exo用于癌症诊断具有灵敏度高、特异性好和时效性强的独特优势，是最具应用潜力的肿瘤早期诊断标志物之一。

常用的Exo传统检测方法包括纳米颗粒追踪分析法(Nanoparticle trackinganalysis，NTA)、免疫印迹法(Western blot，WB)、酶联免疫吸附分析法(Enzyme-linkedimmuno sorbent assay)和流式细胞术(Flow cytometry)等。这些方法检测灵敏度低、所需样本量大、操作过程繁琐，难以满足临床即时检测的需要。为克服上述检测方法的缺陷，多种简便方法已被开发用于Exo的高灵敏检测，例如表面增强拉曼散射、微流控芯片技术、荧光或比色传感检测法等。然而，这些检测方法仍存在一定的局限性：一方面，多数检测方法仅依赖于对Exo普遍表达的跨膜蛋白CD63的特异性识别进行检测，难以区分正常人和肿瘤患者；即使利用CD63与另一种Exo表面肿瘤标志蛋白联合检测，能够在一定程度上改善肿瘤Exo检测的特异性，但目前尚无一种Exo特异性蛋白标志物能够明确诊断肺癌，选择Exo表面多种肿瘤标志物联合检测，可以提高诊断的准确度。另一方面，单强度的传感探针容易受复杂生物样品的干扰，产生假阳性信号。

“邻近连接技术”是指一对分别标记有亲和配体的寡核苷酸探针(称为邻近探针)通过同时识别并结合目标分子，只有当二者由于距离拉近产生邻近效应时，才能给出检测信号，从而保证了检测的高特异性，被成功用于蛋白质的高灵敏和高特异性检测，及细胞表面多种标志物的共定位研究。荧光共振能量转移(FRET)利用激发供体，监测受体荧光发射，能够降低检测背景，减少干扰。因此，结合邻近效应介导的DNA组装及FRET构建Exo表面多种标志物联合检测平台，有望提高肿瘤Exo检测的特异性和抗干扰能力。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用多种标志物联合检测外泌体的试剂盒，以提高肿瘤来源外泌体检测的准确性。

本发明的另一个目的是提供一种利用多种标志物联合检测外泌体的方法。

为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：