[发明专利]一种基于网状杂交链式反应的基因链检测方法

权利要求书

1.一种基于网状杂交链式反应的基因链检测方法，其特征在于，针对circRNA的检测步骤如下：

(1)提取总RNA：从待检测样本中提取总RNA；

(2)逆转录滚环扩增：针对要检测的目标circRNA，在非反向剪切位点的靶序列处选取碱基设计特异性逆转录引物；该引物特异性识别目标circRNA，用不含RNase H的高效逆转录酶进行滚环逆转录，逆转录得到一条长的具有多组重复序列的cDNA单链，该cDNA链上含有多个逆转录后的反向剪切位点序列；

(3)网状杂交链式反应探针设计：针对cDNA链上存在的多个逆转录后的反向剪切位点序列，设计三个HCR探针：Trigger、H1、H2；Trigger用来识别逆转录后的反向剪切位点序列并启动网状杂交链式反应，探针H1、H2进行DNA网状纳米结构的搭建；

(4)网状杂交链式反应：将探针Trigger、H1与H2同逆转录滚环扩增得到的cDNA链在一定温度下共孵育；

(5)荧光信号测定：通过对荧光信号的检测，实现对circRNA的检测；

针对含有多段重复序列的基因检测时，除了网状杂交链式反应探针是针对DNA链上存在的多个重复序列设计的三个HCR探针，并省略掉上述步骤(1)的提取总RNA和步骤(2)的逆转录滚环扩增过程外，其余步骤均同于上述针对circRNA的检测步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中在没有目标反向剪切位点存在的情况下，三个探针保持稳定的发夹结构，不会自发发生自组装；在逆转录后的反向剪切位点存在的情况下，发夹探针Trigger与之部分结合发生构象改变，发夹打开，暴露启动子链；启动子链与H1的发夹结构发生链置换，暴露出两段具有特殊作用的序列；其中一段序列与发夹探针H2发生链置换，使H2也释放出与Trigger相同的启动子链；该启动子链继续与H1、H2进行循环往复的后续组装；而另一段序列是位于H1探针5’端的尾巴，与相邻的H1结合，拉近两个HCR体系之间的距离；由于多组重复序列的存在，它们被H1串联在一起，搭建起稳定的网状结构。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，信号的输出依赖于H1探针上标记的荧光基团与淬灭基团；发夹结构时荧光基团与淬灭基团在空间上紧邻，由于荧光共振能量转移原理荧光淬灭；而在发夹结构打开时荧光基团与淬灭基团在空间上距离拉开，荧光恢复。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中：Trigger探针包括a'、b'、c、b四部分，其中a'、b'段与逆转录后的反向剪切位点处序列互补配对，且分别包含6-10个、10-14个碱基，c为6-12个随机碱基序列，b为b'的互补配对序列；H1包括d'、e、b、d、b'、c'，d'为4-8个随机碱基序列，e为5-7个随机碱基序列，d、c'分别为d'、c的互补配对序列；H2包括b'、e'、c、b四部分，其中e'为e的互补配对序列；在没有目标反向剪切位点存在的情况下，三个探针保持稳定的发夹结构，不会自发发生自组装；在逆转录后的反向剪切位点存在的情况下，发夹探针Trigger与之部分结合发生构象改变，发夹打开，暴露启动子链；启动子链与H1的发夹结构发生链置换，暴露出两段具有特殊作用的序列；其中一段序列与发夹探针H2发生链置换，使H2也释放出与Trigger相同的启动子链；该启动子链继续与H1、H2进行循环往复的后续组装；而另一段序列是位于H1探针5’端的尾巴，与相邻的H1结合，拉近两个HCR体系之间的距离；由于多组重复序列的存在，它们被H1串联在一起，搭建起稳定的网状结构。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中网状杂交链式反应的孵育温度为27℃-33℃，孵育时间为3h-4h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中探针Trigger、H1与H2的终浓度分别为0.03-0.07μM、0.08-0.15μM与0.08-0.15μM。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，H1探针上标记的荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ-1。