[发明专利]一种KASP-SNP分子探针及其检测方法与应用

说明书

本发明提供了一种检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的KASP‑SNP分子探针，包括正向引物F1、正向引物F2和反向引物R；还提供了检测方法：提取小麦的条形柄锈菌的基因组DNA，得到待检测基因组DNA，用KASP‑SNP分子探针对所述待检测基因组DNA进行PCR扩增得到PCR扩增产物，PCR板冷却至室温后，用酶标仪进行检测，然后将数据导入Kluster Caller软件进行基因分型，敏感性条形柄锈菌的碱基类型为AA，荧光显示为蓝色；抗药性条形柄锈菌的碱基类型为AT或者TT，其中AT为杂合抗药类型，荧光显示为绿色，TT为纯合抗药类型，荧光显示为红色。还提供了应用，用于快速检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂的抗药性。本发明的KASP‑SNP分子探针用于小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的快速检测。

技术领域

本发明属于三唑类杀菌剂抗药性检测技术领域，具体涉及一种检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的KASP-SNP分子探针及其检测方法与应用。

背景技术

由条形柄锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)引起的条锈病是小麦上最重要的真菌病害，常年威胁小麦安全生产，病害大流行年份造成严重减产甚至绝收。化学防治是小麦条锈病应急防控的重要手段，三唑类杀菌剂(主要是三唑酮)用于中国小麦条锈病防治已愈四十年。单一药剂的长期使用已引致条形柄锈菌对该类杀菌剂的抗药性，然而由于条形柄锈菌为严格活体专性寄生真菌，迄今未有有效方法检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂的抗药性，导致田间过量用药并且达不到之前的防效，一方面增大防治成本，另一方面造成环境污染。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的KASP-SNP分子探针及其检测方法与应用，该KASP-SNP分子探针用于小麦条形柄锈菌三唑类杀菌剂抗药性的快速检测。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的KASP-SNP分子探针，所述KASP-SNP分子探针包括正向引物F1、正向引物F2和反向引物R；所述正向引物F1具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述正向引物F2具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述反向引物R具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

本发明还提供了上述的KASP-SNP分子探针检测小麦条形柄锈菌对三唑类杀菌剂抗药性的方法，该方法为：

S1、提取小麦条形柄锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)夏孢子的基因组DNA，得到待检测基因组DNA；

S2、以S1中得到的待检测基因组DNA为模板，用KASP-SNP分子探针对所述待检测基因组DNA进行PCR扩增得到PCR扩增产物，PCR扩增的反应体系为：浓度为25ng/μL的待检测基因组DNA 1.0μL、2×Taq MasterMix 10μL、10μM的正向引物F10.5μL、10μM的正向引物F20.5μL、10μM的反向引物R1μL、ddH₂O补足至20μL；

PCR扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸45s、每个循环延伸温度降低1℃，进行10次循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，进行20次循环；72℃终延伸10min，反应终止；

S3、待PCR板冷却至室温后，将S2中得到的PCR扩增产物，用酶标仪进行检测，然后将数据导入Kluster Caller软件进行基因分型，敏感性条形柄锈菌的碱基类型为AA，荧光显示为蓝色；抗药性条形柄锈菌的碱基类型为AT或者TT，其中AT为杂合抗药类型，荧光显示为绿色，TT为纯合抗药类型，荧光显示为红色。