[发明专利]以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒4种点突变S基因鉴别试剂盒及其鉴别方法

说明书

本发明公开了一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒4种点突变S基因鉴别试剂盒及其鉴别方法，涉及生物医药领域，其特点是根据新型冠状病毒S基因的4个不同突变位点设计扩增引物，通过优化的高分辨率熔解曲线反应体系鉴别不同位点突变的S基因。本试剂盒操作简单、反应速度快、PCR产物无需后处理、具备可操作性与重现性，可用于不同位点突变的新型冠状病毒S基因的鉴别。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒点突变S基因鉴别试剂盒及其检测方法及应用。

背景技术

新冠肺炎疫情自爆发以来，给人类社会带来了巨大的灾难，且至今仍未得到有效控制。新型冠状病毒的快速传播不仅严重影响了全球公共卫生事业发展，也对口岸卫生检疫及疫情防控提出了更高的要求。基因突变是病毒在自然演变中常见的现象，已有研究表明新型冠状病毒突变体可能使它们具有更强的传播性，或者产生逃避某些抗体免疫反应的能力。新冠病毒表面的刺突蛋白(spike protein, S)在病毒传播中起着十分重要的作用，对S基因突变病毒的快速鉴定不仅有利于疫情防控，也有助于进一步监控病毒的传播及演化进程。因此，口岸新冠检疫急需发展安全、快速、准确、灵敏的突变基因快速检测方法，以实现新型冠状病毒S基因突变体快速鉴定。

近年来，随着分子生物学技术的发展，单链构象异构多态分析技术（SSCP）、高效液相色谱法以及一代、二代、三代测序及宏基因组测序等分子手段均已成功应用于已知或未知突变基因的鉴定。然而，这些鉴定方法均有不足之处：SSCP虽然灵敏度较高，但只能通过电泳区分正常链及突变链，要确定突变类型及突变基因位点仍需进一步测序，且电泳条件要求比较严格；高效液相色谱法只能检查有无突变，不能检测出突变类型，并且结果判断易出错；测序技术应用广泛，但是耗时长、花费高，并不适用于口岸快速检测的要求。鉴于上述方法的不足，为了安全、快速、准确、灵敏的实现突变基因的分子鉴定，需要探寻新的分子鉴定手段。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒点突变S基因鉴别试剂盒可作为突变S基因新的鉴别手段，它以单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线为基础进行突变基因鉴定，操作简单、速度快、低成本、高通量、结果准确、不受检测位点的局限、PCR 产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异等优势，实现真正的闭管操作从而降低污染风险，非常适合大量样品的分析。

本发明是由以下技术方案来实现的：

本发明设计了一组以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒N501Y、A570D、S982A、D1118H位点突变的S基因鉴别引物，引物特异性强，灵敏度高。序列如下：

N501Y-F：5’-AGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAG-3’ ；

N501Y-R：5’-TCCACAAACAGTTGCTGGTGCATGT-3’ 。

A570D-F：5’-GTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTAC-3’ ；

A570D-R：5’-CACCACCAAAAGAACATGGTGTAAT-3’ 。

S982A-F：5’-CAAGCTTTAAACACGCTTGTTAAAC-3’ ；

S982A-R：5’-TGTCTGCAAACTTTGAAGTCTGCCT-3’ 。

D1118H-F：5’-TGTCTTTGTTTCAAATGGCACACAC-3’ ；

D1118H-R：5’-GGTTGCAAAGGATCATAAACTGTGT-3’ 。

利用上述的检测引物，本发明提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒点突变S基因鉴别试剂盒，包括如下成分：

1）针对N501Y、A570D、S982A、D1118H四个突变位点的S基因特异性鉴别引物。