[发明专利]一种染料化合物的制备方法

说明书

本发明公开了一种染料化合物的制备方法，将1,5‑二氨基‑4,8‑二羟基蒽醌与2‑氯胺盐反应，得到中间产物；中间产物与两端为羧基的化合物反应，得到染料化合物，为RedNucleusⅡ染料。本发明公开的RedNucleus Ⅱ远红外染料，该染料具有更好的光谱特性，不受紫外激发，也不与PE及PE同系物重叠发射，与PE连用时无需补偿调节，可完美解决现有7‑AAD带来的技术问题；关键是本发明试剂盒测试时无需设置两种染料的单染补偿管，无需进行两种染料间的补偿调节，这不仅节省了广大实验人员的宝贵时间，也让实验步骤不再繁琐，从而利于产业化应用。

本发明为发明名称为RedNucleusⅡ染料及其制备方法与基于该染料的细胞凋亡检测试剂盒、申请日为2019年11月21日、申请号为2019111499637发明申请的分案申请，为染料制备方法部分。

技术领域

本发明属于试剂盒技术，具体涉及Annexin V-PE/ RedNucleusⅡ凋亡检测试剂盒，用于定量分析检测细胞凋亡。

背景技术

细胞凋亡（apoptosis）是指细胞为维持内环境稳定，更好地适应生存环境而主动争取的由基因控制的细胞自主性死亡。在机体的胚胎发育，组织修复，内环境稳定的方面起分厂重要的作用。目前细胞凋亡的检测方法主要有3大类：形态学观察，生化特征检测，流式细胞术定量分析。细胞凋亡有许多特征是重叠的，因此更加需要一种精确的检测方法验证细胞具体的死亡方式，流式细胞术定量分析法因其在检测细胞凋亡时简单、快速，灵敏性高和准确性好的特点，成为检测细胞凋亡的主要手段。

流式细胞术定量分析检测细胞凋亡的方法主要有DNA含量分析法、AnnexinV法、线粒体膜电位检测法、钙离子浓度检测法，其中AnnexinV法的灵敏性与准确性是相对来说较高的一种测试方法。目前市面上常见的AnnexinV法试剂盒有Annexin V-PE/7-AAD双染试剂盒，将标记了的Annexin V与7-AAD匹配使用，便可用流式细胞术将细胞的早期凋亡与晚期凋亡区分开，但PE与7-AAD这两种染料的光谱重叠较大，使用时两种染料之间的补偿较大，因此必须要设置的两种染料的单染补偿管，调节补偿后才能不影响实验结果。这样的实验方法使实验步骤十分繁琐，并且会消耗更长的实验时间，对细胞的状态有很大的影响，以致最终的实验结果不准确。

发明内容

PS）发生特异性结合的特点，将Annexin 本发明试剂盒提供一种RedNucleus Ⅱ的远红外染料，该染料具有更好的光谱特性，不受紫外激发，也不与PE及PE同系物重叠发射，与PE连用时也无需补偿调节，可完美替代7-AAD，进行细胞凋亡检测；利用Annexin V进行荧光素PE标记，而RedNucleus Ⅱ属于核酸荧光染料，它不能透过正常细胞膜，只能进入已破损的细胞膜，可以定量分析检测细胞凋亡。 V能与细胞发生早凋后由膜内外翻到膜外的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,

本发明采用如下技术方案：

染料化合物，具有如下化学结构式：

其中，X为桥接基团；Z为烷基；R₁、R₂、R₃独立的选自小于8个碳的烷基或者环烷基。

本发明中，Y为配位阴离子，为常规技术，比如卤素。

本发明中，X为包括1～30个碳且任选含有杂原子的烷基。优选的，杂原子为N或者O；杂原子位于X的支链和/或者主链上。

本发明中，Z为含有1～10个碳原子的直链烷基。

本发明公开了上述染料化合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）1,5-二氨基-4,8-二羟基蒽醌与氯胺盐反应，得到中间产物；

（2）中间产物与两端为羧基的化合物反应，得到染料化合物。