[发明专利]一种编辑水稻巨胚基因GE培育巨胚粳稻品种的方法

说明书

本发明公开一种编辑水稻巨胚基因GE培育巨胚粳稻品种的方法。本发明通过CRISPR‑Cas9多靶点系统对控制水稻胚大小的GE巨胚基因进行定点编辑，并进行粳稻遗传转化获得巨胚转基因植株，对后代进行转基因插入片段的检测，可以缩短育种周期快速获得多种无转基因片段插入的大小种胚的粳稻品种，每种不一样种胚大小的ge基因型突变株其糙米含有的GABA含量也有差异，并且随着胚的增大GABA含量也同时增加，不同大小胚重的水稻品种可以满足提取不同含量的GABA，以满足不同消费群体的需求。因此，本发明可为不同GABA含量需求的生产应用提供一种高效的基因敲除方法和培育多个巨胚粳稻品种的方法。

技术领域

本发明涉及植物转基因技术及作物遗传育种领域，具体涉及一种编辑水稻巨胚基因GE培育巨胚粳稻品种的方法；特别涉及一种利用CRISPR-Cas9多靶点技术编辑水稻GE基因获得多种GE等位基因型突变体，产生多种种胚比野生型大的巨胚材料，培育多个无转基因片段插入的巨胚粳稻品种的育种方法。

背景技术

水稻是我国重要的粮食作物，是我国50%以上人口的主食，近年来，随着人民生活水平的提高，人们对水稻营养品质有了更高的追求。功能稻米是指除了具有一般稻米的营养成分外，还富含某些生理活性物质，是对于调节人体生理代谢和满足高血压高血糖等特殊消费群体等需求的专用和保健性水稻。γ-氨基丁酸、维生素E、膳食纤维、必需氨基酸、酚类、肌醇、谷维素和N-去氢神经酰胺等多种功能性生理活性物质均富集于胚中。

巨胚水稻是一种胚变大的水稻品种，属于功能稻的一种。巨胚米的胚重一般是正常米胚重的2～3倍，有的胚重甚至更大，使得巨胚糙米中富含γ-氨基丁酸、维生素E和必需氨基酸等，并显著高于普通胚水稻糙米。由于巨胚米的胚增大而使其营养价值极大提高，具有独特和潜在的经济利用价值。巨胚水稻中富含的γ-氨基丁酸（Gamma-amino butyricacid），又称γ－氨酪酸，简称GABA，是一种天然存在的非蛋白组成性的功能性氨基酸，具有重要的医药价值。GABA在植物组织中存在，同时在哺乳动物和人类的中枢神经系统中也存在，是中枢神经系统中很重要的抑制性神经递质，参与人体内多项代谢及生理活动，具有降低血压、抗衰老、活化肝肾、促进乙醇代谢和改善脑细胞代谢等功效，在一定程度上，还能够改善更年期女性失眠、焦虑及抑郁等症状，被誉为“大脑的天然镇静剂”。近年来更有研究显示，GABA能够改善糖尿病症状。另外巨胚水稻中富含的维生素E是一种重要的抗氧化剂，在人体中能有效发挥抗氧化能力，并清除人体自由基、延缓衰老，对高血脂症的预防和治疗也具有明显疗效。

普通水稻籽粒中的GABA含量较低，获得巨胚水稻品种可以显著增加籽粒中的GABA含量。最开始由日本学者利用化学诱变剂MNU（Methyl-nitrosourea）处理水稻金南凤品种合子细胞而率先获得巨胚突变体；随后，韩国学者也应用MNU化学诱变剂处理水稻受精卵，从变异群体中选育出巨胚水稻；我国科研人员主要利用日本的巨胚种质，其次还有采用Co60-γ射线照射等诱变技术，通过自交和杂交育成巨胚稻品系。已发现水稻中的巨胚性状由隐性单基因控制，已克隆到的控制水稻籽粒胚大小的巨胚基因GE（Giant embryo），即Os07g0603700，编码细胞色素P450家族中的一种蛋白，该蛋白被定名为CYP78A13。目前主要通过对该基因进行诱变和杂交选育技术来获得巨胚水稻，然而，这些育种方法所需的成本高、劳动强度大且育种周期长，所获得的巨胚稻种胚大小分布有限。CRISPR（Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats）-Cas9基因组编辑技术已成熟应用在各种生物体内进行基因组编辑，也被大量用于创造定向水稻基因突变材料，进行快速有效的水稻遗传改良。

发明内容