[发明专利]一种伊枯草菌素抑菌活性的定量测定方法

说明书

本发明属于生物活性肽检测技术领域，具体涉及一种伊枯草菌素抑菌活性的定量测定方法，包括：对待检测样品进行对应的处理，得到伊枯草菌素样液；制备对数期指示菌；制备含指示菌的MH培养平板；肽液点样和细菌培养；结果计算。本发明的伊枯草菌素抑菌活性的定量测定方法，可以对制备/纯化伊枯草菌素及其产品的各个环节得到的样品中的伊枯草菌素的抑菌活性定量测定计算，实现了伊枯草菌素生产过程中各个环节以及各种形式的产品的伊枯草菌素活性的统一监控，只需要一套实验设备及流程，节省了质量监控的成本。本发明的伊枯草菌素抑菌活性的定量测定方法，能快速准确地得出结果，操作简便、计算步骤简洁，非常适合在规模化生产中应用。

技术领域

本发明属于生物活性肽检测技术领域，具体涉及一种伊枯草菌素抑菌活性的定量测定方法。

背景技术

伊枯草菌素为一种肽类抗菌物质。抗菌肽或肽类抗生素为生物体内稳定存在或在创伤感染后诱导产生的一类活性分子。其分子量较抗生素大,分子结构复杂。抗菌肽具有水溶性好,无免疫原性,抗菌性广谱等特点，并对肿瘤细胞、病毒、真菌和原虫等有杀伤作用,是一类令致病菌很难产生耐药性的药物，在替代传统抗生素药方面具有很大潜力。

有关抗菌肽的研究均集中于提取、分离纯化及基因表达等方面。然而,在抗菌肽分离纯化过程中,如何监控其活性是最重要的。因此,在抗菌肽分离的每一步均要跟踪测定抗菌肽的活性,否则就失去了分离、纯化的意义。测定抗菌肽活性的方法有很多种,其中定性方法主要是琼脂扩散法，包括滤纸片法、平板打孔法和牛津杯法,三者都是通过抑菌圈的大小来直观反映其抑菌活性；定量方法主要是酶标比浊法和活菌计数法。但由于各种方法均有自身特质和明显利弊，目前无法统一抗菌肽活力计算标准，这就导致了抗菌肽的生产过程中对质量的评价无法统一。

发明内容

鉴于此，有必要针对上述问题提供一种伊枯草菌素抑菌活性的定量测定方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种伊枯草菌素抑菌活性的定量测定方法，包括：

对待检测样品进行对应的处理，得到伊枯草菌素样液；

制备对数期指示菌；

制备含指示菌的MH培养平板；

肽液点样和细菌培养；

结果计算。

需要说明的是：所述“对待检测样品进行对应的处理，得到伊枯草菌素样液”、“制备对数期指示菌”和“制备含指示菌的MH培养平板”三项操作并无先后顺序，只需要在“肽液点样和细菌培养”操作之前将所述三项完成即可。

进一步的，所述“对待检测样品进行对应的处理”中的待检测样品包括：灭菌前的发酵液、灭菌后的发酵液、伊枯草菌素发酵液浓缩膏、伊枯草菌素初级预混剂、含伊枯草菌素的产品等中的至少一种。

进一步的，所述“对待检测样品进行对应的处理”的操作包括以下情况中的至少一种处理方式：

(1)对于灭菌前的发酵液，先用无菌水稀释至少2倍，离心(3000～4000rpm，10～20分钟)，至上清液澄清后，吸取上清液进行点样操作。

(2)对于灭菌后的发酵液，直接离心(3000～4000rpm，10～20分钟)，至上清液澄清，吸取上清液10μl进行点样操作。

(3)对于伊枯草菌素发酵液浓缩膏，先用无菌水稀释10倍，离心(3000～4000rpm，10～20分钟)，至上清液澄清，再吸取上清液10μl进行点样操作。此处理方式中，稀释倍数与浓缩倍数有关，此处采用的浓缩膏是灭菌液经10倍浓缩后得到的，故此处稀释10倍，如浓缩倍数为其他数值，此处的稀释倍数对应其浓缩倍数的其他数值。