[发明专利]基于多重扩增和探针捕获的组合对单链DNA序列富集测序的方法及在突变检测中的应用

权利要求书

1.一种基于多重扩增和探针捕获的组合对单链DNA序列富集测序的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提供来自生物样本的单链状态的DNA片段，在所述DNA片段的末端连接一连接臂，所述连接臂设计为能够通过接头的互补臂与接头连接；

(2)通过局部双链互补配对和连接反应使所述DNA片段的末端与接头连接，局部双链结构有助于提高单链连接效率；

(3)加热使所述接头与所述DNA片段分离，从而形成单链状态的第一扩增模板；

(4)利用所述第一扩增模板进行多重PCR，得到第二扩增模板，其中，所述多重PCR的引物包括特异性引物和第一INDEX引物；

(5)利用所述第二扩增模板进行通用PCR，得到杂交捕获用片段，所述通用PCR的引物包括通用引物和第二INDEX引物；

(6)使探针和所述杂交捕获用片段进行接触，从而捕获目标片段。

2.根据权利要求1所述的基于多重扩增和探针捕获的组合对单链DNA序列富集测序的方法，其特征在于，进一步包括进行捕获后PCR，从而得到测序文库的步骤，其中测序文库中的片段长度为150-500bp。

3.根据权利要求1所述的基于多重扩增和探针捕获的组合对单链DNA序列富集测序的方法，其特征在于，所述第一INDEX引物和所述第二INDEX引物为相同引物。

4.根据权利要求3所述的基于多重扩增和探针捕获的组合对单链DNA序列富集测序的方法，其特征在于，所述特异性引物包含第一通用引物结合序列和能够与目标序列一侧的序列特异性互补结合的结合序列，所述第一INDEX引物或所述第二INDEX引物各自分别包含第二通用引物结合序列和INDEX序列，且第一INDEX引物和第二INDEX引物各自的至少一部分与所述接头的序列的至少一部分相同，从而能够使INDEX引物能够与所述DNA片段形成双链结构。

5.根据权利要求4所述的基于多重扩增和探针捕获的组合对单链DNA序列富集测序的方法，其特征在于，所述第一通用引物结合序列和所述第二通用引物结合序列为相同的序列。

6.根据权利要求1所述的基于多重扩增和探针捕获的组合对单链DNA序列富集测序的方法，其特征在于，所述生物样本为血液，包括全血、血浆、血清；所述DNA片段为cfDNA或ctDNA或人工片段化DNA片段。

7.根据权利要求1所述的基于多重扩增和探针捕获的组合对单链DNA序列富集测序的方法，其特征在于，所述接头包含条形码序列。

8.根据权利要求1所述的基于多重扩增和探针捕获的组合对单链DNA序列富集测序的方法，其特征在于，进一步包括对测序文库进行测序的步骤。

9.根据权利要求1所述的基于多重扩增和探针捕获的组合对单链DNA序列富集测序的方法，其特征在于，所述连接臂为poly C，C的个数为1-10；所述互补臂为poly G，G的个数为1-10。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法在单链DNA突变检测中的应用。