[发明专利]实时荧光定量PCR检测试剂盒、判断槟榔幼苗缺锌状态的方法

权利要求书

1.一种ZIP基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述ZIP基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括一组AcZIP表达水平检测引物和一对槟榔内参基因。

2.如权利要求1的，ZIP基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述引物ZIP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述引物ZIP2核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述引物对中的两条单链DNA既可分贝单独包装，也可等摩尔混合包装。

3.一种如权利要求1所述ZIP基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒在检测槟榔是缺铁还是缺锌中的应用，其特征在于，所述ZIP基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒在检测槟榔是缺铁还是缺锌中的应用方法，包括：

提取待测样品的基因组RNA，逆转录为cDNA为模板，使用试剂盒中的ZIP基因检测引物与内参引物进行RT-qPCR反应，以正常样品为对照，按照2^(-ΔΔCt)计算相对丰度，得到基因的相对表达量；

根据AcZIP家族的相对表达量，若ZIP1在新叶中表达量没有显著变化，在根中表达量显著增加，ZIP2在新叶中表达量显著上调，在根中没有显著变化，说明植株受到缺锌胁迫。

4.一种通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺锌状态的方法，其特征在于，所述通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺锌状态的方法包括以下步骤：

步骤一，实验基地进行槟榔缺锌的处理；

步骤二，进行样品的采集；

步骤三，进行ZIP家族分析；

步骤四，进行引物设计；

步骤五，进行引物的特异性验证；

步骤六，进行实时荧光定量PCR检测。

5.如权利要求4所述通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺锌状态的方法，其特征在于，步骤一中，所述实验基地进行槟榔缺锌的处理，包括：

在实验基地以Hoagland为配方，采用水培的方法对一叶期进行适应性培养后的槟榔幼苗进行缺铁和缺锌的处理，每隔一周时间进行培养液的更换，直到槟榔幼苗出现明显的表型；其中，缺锌的槟榔幼苗的新叶呈网格状的黄化现象。

6.如权利要求4所述通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺锌状态的方法，其特征在于，步骤二中，所述样品的采集，包括：

对出现黄化现象的槟榔幼苗的叶片以及主根进行收集，用75%的乙醇擦拭干净，用液氮冻干，用天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取样品的RNA，cDNA合成根据反转录试剂盒操作进行，-20℃冻存。

7.如权利要求4所述通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺锌状态的方法，其特征在于，步骤三中，所述ZIP家族分析，包括：

ZIP家族PF02535在植物铁和锌的转运中起到重要作用；选取在转录组中差异表达的两组ZIP基因来区分缺锌，四组ZIP基因简单命名为ZIP1和ZIP2。

8.如权利要求4所述通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺锌状态的方法，其特征在于，步骤五中，所述引物的特异性验证，包括：

以提取的正常样品的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增的目的条带的大小分别为267bp和291bp；回收PCR产物，连接T载，进行测序，与ZIP1和ZIP2的核酸序列进行比较，以检测该引物的特异性；其中，所述ZIP1的核酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述ZIP2的核酸序列如SEQID NO：5所示；

其中，所述PCR反应体系，包括：

总反应体系：25μL；2*Vazyme LAMP Master Mix：12.5μL；ZIP-F：1μL；ZIP-R：1μL；cDNA：1μL；ddH₂O：9.5μL；

所述PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃补充延伸10min；PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测。