[发明专利]一种截短版肺炎球菌表面蛋白A的发酵工艺及纯化方法

说明书

本发明公开了一种适用于截短版肺炎球菌表面蛋白A，即PspA₄^(αHD+PRD)的发酵工艺、纯化和保存的方法。所述纯化方法包括精纯化的步骤，即将所述含PspA₄^(αHD+PRD)蛋白的粗产物经弱阴离子交换层析、疏水层析和阳离子交换层析后，获得精纯化的PspA₄^(αHD+PRD)蛋白；所述PspA₄^(αHD+PRD)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。通过本发明制造的重组PspA₄^(αHD+PRD)精纯蛋白产量可达204.9mg/L发酵液，纯度达98％以上，内毒素含量低于检测限度。本发明公开的PspA₄^(αHD+PRD)蛋白制造工艺具有产量高、纯度高、收率高、易放大、工艺稳定性强等特点，在重组PspA₄^(αHD+PRD)蛋白的生产制造领域具有极为广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及利用基因工程技术生产重组蛋白药物，具体涉及一种截短版肺炎球菌表面蛋白A(PspA₄^(αHD+PRD))的高效可溶高表达和制造工艺，属于基因工程技术和医药技术领域。

背景技术

肺炎链球菌是一种常见的革兰氏阳性菌，含荚膜，其主要的致病原也来源于丰富的荚膜多糖和多种毒力蛋白。肺炎链球菌常诱发老人和儿童感染肺炎、脑膜炎、中耳炎及败血症等疾病，是威胁老人和儿童生命健康的重要病原菌之一。

目前已分离鉴定出的肺炎球菌型别有90多种，其中有20多种血清型对应的肺炎球菌具有较强的感染力。针对这些较强感染力的肺炎球菌，科学家们研制出了23价多糖疫苗(Ppv23)和多糖蛋白结合疫苗(PCV-7，PCV-13)。相较于多糖疫苗(Ppv23)，多糖蛋白结合疫苗能激发机体免疫记忆效应，对65周岁以上的老人和5周岁以下的儿童的保护率有显著提升。但随着流行菌株血清型的改变，出现了疫苗保护之外的血清型肺炎球菌感染，需开发价数更高的疫苗产品才能得以保护。但制备生产更多价数的多糖蛋白结合疫苗(如PCV-23等)工艺极为复杂，且成本较高，这在今后的疫苗研发战略中也不切实际。因此，研制不受肺炎球菌型别限制的新型肺炎球菌疫苗具有极大的应用前景。

肺炎球菌表面蛋白A(Pneumococcal Surface Protein A，PspA)是肺炎球菌毒力相关的一种重要表面抗原，几乎分布于所有临床分离的肺炎球菌中。PspA蛋白能够抑制机体的补体沉淀，从而避免机体吞噬调理作用。动物学实验表明，PspA产生的特异性抗体能帮助小鼠避免肺炎球菌侵袭。PspA在肺炎球菌中保守性较低，其主要由3个结构域组成：(1)280-380个氨基酸的N-末端区域，该区域由大量α螺旋卷曲结构组成(α-helix domin,αHD)；(2)紧接着是约90个氨基酸的脯氨酸富集区(Prolin-rich domin,PRD)；(3)最后是一个含有约200个氨基酸的胆碱结合区，且带着约17个疏水氨基酸尾巴的C-末端区域。PspA的多样性主要体现在αHD，该区域的氨基酸序列具有高度变异性，其中靠近PRD附近的100个氨基酸被定义为分枝定义区(CDR)，该分枝定义区将PspA蛋白分为3个家族(Family)和6个分枝(Clade)，分别为：家族1，包含分枝1和分枝2；家族2，包含分枝3，分枝4和分枝5；家族3，由分枝6组成。大量研究表明，同一分枝的PspA能产生高强度的免疫保护反应，同一家族不同分枝的PspA也能产生较高强度的免疫交叉保护，而不同家族的PspA则不能总是产生一定强度的免疫交叉保护反应。基于流行病学研究，含家族2中PspA的肺炎球菌广泛流行于西班牙、美国、加拿大、瑞典及法国等国及亚洲局部，而家族1中的PspA则广泛流行于英国、日本和澳大利亚等国。综上，地区差异性导致了PspA型别的差异性。