[发明专利]一种产D-塔格糖的基因工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1. 一种用于生产D-塔格糖的基因工程菌，记为E.coli BL21/β-gal-L-AI，其特征在于，其通过在E.coli BL21上构建表达L-阿拉伯糖异构酶和β-半乳糖苷酶而得到；所述用于生产D-塔格糖的基因工程菌的构建方法，包括：

(1)L-阿拉伯糖异构酶工程菌的构建：

PCR扩增来源于植物乳杆菌中的L-阿拉伯糖异构酶基因，使用无缝克隆技术克隆至表达载体pANY1中，得到重组质粒pANY1-araA，经过将重组质粒转化至E.coli DH5α、筛选阳性克隆、测序得到E.coli DH5α/L-AI，然后将E.coli DH5α/L-AI培养、抽提重组质粒，并将重组质粒转化至E.coli BL21感受态中，得到L-阿拉伯糖异构酶工程菌，记为E.coli BL21/L-AI；

(2)β-半乳糖苷酶工程菌的构建：

PCR扩增来源于罗伊氏乳杆菌中的β-半乳糖苷酶基因，使用无缝克隆技术克隆至表达载体pFXZ02中，得到重组质粒pFXZ02-lacLM，经过将重组质粒转化至E.coli DH5α、筛选阳性克隆以及测序得到E.coli DH5α/β-gal，然后将E.coli DH5α/β-gal培养、抽提重组质粒，并将重组质粒转化至E.coli BL21感受态中，得到β-半乳糖苷酶工程菌，记为E.coli BL21/β-gal；

(3)基因工程菌E.coli BL21/β-gal-L-AI的构建：

利用CaCl ₂ 法制备E.coli BL21/β-gal感受态细胞，并将重组质粒pANY1-araA热激法转化入E.coli BL21/β-gal感受态细胞中，涂布于含Kan-Cl-LB双抗平板上，经阳性克隆子的筛选与验证，获得基因工程菌E.coli BL21/β-gal-L-AI；

其中，步骤(1)和(2)不分先后顺序。

2.根据权利要求1所述的用于生产D-塔格糖的基因工程菌，其特征在于，步骤(1)中PCR扩增的条件为：预变性：98℃、3min，变性：98℃、10s，退火：58℃、30s，延伸：72℃、45s，终延伸：72℃、10min，35个循环。

3.根据权利要求1所述的用于生产D-塔格糖的基因工程菌，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增的条件为：预变性：98℃、3min，变性：98℃、10s，退火：58℃、30s，延伸：72℃、85s，终延伸：72℃、10min，35个循环。

4.权利要求1所述的用于生产D-塔格糖的基因工程菌在制备D-塔格糖中的应用。

5.一种分批补料乳清粉产D-塔格糖的方法，其特征在于，具体包括：

(1) 制备同时含过表达β-gal与L-AI的重组静息细胞：

将权利要求1所述基因重组菌E.coli BL21/β-gal-L-AI接种于Kan-Cl-LB双抗培养基中，向其中加入IPTG诱导表达，获得表达成功的E.coli BL21/β-gal-L-AI，将表达成功的E.coli BL21/β-gal-L-AI低温离心，然后用含Triton-x-100的磷酸钠缓冲液室温处理离心后的细胞，接着再次离心，收集细胞，洗涤，得到同时含过表达β-gal与L-AI的重组静息细胞；

(2) 分批补料乳清粉制备D-塔格糖：

将步骤(1)中制得的重组静息细胞加入乳清粉溶液混合反应，并采取分批补料乳清粉的方式进行转化以制备D-塔格糖；

所述分批补料乳清粉的方式为在反应5h或12h后向反应液中补充终浓度为50-60g/L乳糖的乳清粉，共补料4～6次，补料结束后继续反应至D-塔格糖浓度不增加为止。

6.根据权利要求5所述的分批补料乳清粉产D-塔格糖的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述IPTG的终浓度为1mM；所述含Triton-x-100的磷酸钠缓冲液中Triton-x-100的体积分数为2％。