[发明专利]一种改善测序混样均匀性的定量混样方法

说明书

本发明涉及一种改善测序文库混样均匀性的方法，该方法通过对测序文库进行高温预处理后再定量，可有效地解决文库DNA特殊结构对Qubit浓度定量的影响，进而改善二代测序混样均匀性，能准确均一化文库的浓度，产出数据量更为均一，使数据利用率更高。相比于其他方法，本发明成本更低，方法更简单。

技术领域

本发明涉及基因测序技术领域，具体涉及一种改善测序混样均匀性的定量混样方法。

技术背景

高通量测序中，文库浓度定量的准确性是测序数据量产出均一性的基础性工作。传统的高通量测序流程中，广泛采用的是荧光定量方法和qPCR定量方法。

荧光定量方法是利用荧光定量仪，以及配套的Qubit试剂，其原理为特定荧光染料选择性地特异性靶分子结合，发射荧光信号，随后被定量仪检测。双链DNA定量的具体做法为，首先将Qubit dsDNA检测试剂盒中浓缩的检测试剂和稀释缓冲液按照1:199的比例配置混合液，随后取DNA/RNA文库取2μL，加入到198μL混合液中，震荡混匀，上机定量。然而该方法具有选择局限性，Qubit dsDNA检测试剂对双链DNA(dsDNA)具有高度选择性。待检测样本在提取建库的过程中，难免会有一些特殊的处理方式来达到自己的实验目的。然而该处理方式极有可能会导致建出的DNA文库存在特殊结构，该特殊结构会严重影响Qubit dsDNA对二代测序文库的准确定量，最终测序数据量的产出均一性变差。

另外，qPCR能够有效准确的定量DNA文库浓度，混样比例均一、稳定，但是qPCR定量却延长了实验流程周期约2小时，检测的时效性降低，而且qPCR对人员操作的稳定性、熟练性要求过高，容易出现人为失误。

有鉴于此，提出本发明。

发明内容

本发明要解决的核心问题是寻求一种能够改善测序，尤其二代测序混样均匀性的定量混样方法。为解决上述问题，本发明进行大量优化开发，最终惊奇的发现，出库的文库通过热变性处理，能改变文库中的特殊结构，但不影响文库的整理质量，再使用QubitssDNA/dsDNA检测试剂盒进行定量，尤其使用Qubit dsDNA检测试剂盒，处理后的定量结果能够显著改善文库定量的均一性。同时热变性耗时短，对操作人员的技术水平要求相对较低，操作极其简单。

具体的本发明提出如下技术方案：

本发明首先提供一种测序文库的定量方法，所述方法包括：

步骤1)对测序文库进行热变性处理；

步骤2)采用荧光定量试剂盒进行定量。

进一步的，所述步骤1)中的热变性处理后再进行冰上静止处理。

进一步的，所述步骤1)中的热变性处理为80-99℃高温处理后2-4min，瞬时离心，立即冰上静置3-5min。

在一些优选的实施方式中，所述步骤1)中的热变性处理为80-99℃处理2min，瞬时离心，冰上静置5min。

进一步的，所述步骤2)中的荧光定量方法为基于Qubit dsDNA或QubitssDNA检测试剂盒进行定量；优选的，为基于Qubit dsDNA检测试剂盒进行定量。

进一步的，上述测序为一代测序、二代测序或三代测序；优选的，所述测序为NGS二代测序。

更进一步的，所述测序文库为宏基因组测序文库。

本发明还提供一种改善测序混样均匀性的定量混样方法，所述方法包含上述定量方法，并进一步包括混样处理步骤。

本发明还提供一种测序文库构建方法，包括常规测序文库构建步骤，还包括上述的定量或定量混样方法。

本发明还提供一种测序文库构定量混样剂盒，包含Qubit dsDNA检测试剂盒基础组分，以及实施热变性处理的材料组分，比如耐热管等。