[发明专利]新型冠状病毒肺炎DNA纳米疫苗及其制备方法

说明书

本发明公开了一种针对新型冠状病毒肺炎DNA纳米疫苗及其制备方法，将传统编码新型冠状病毒外壳上刺突蛋白(S)的DNA胞质尾区域删除为S.dCT DNA，与阳离子聚合物通过静电相互作用自组装成纳米疫苗，其中阳离子聚合物为PAsp(EDA)、PAsp(DET)、PAsp(TET)、PAsp(TEP)、PAsp(BAP)、PAsp(TAE)或PAsp(TAP)中的一种或它们的同类型衍生物。本发明制备的DNA纳米疫苗有较高的转染效率，优化的DNA可以增加刺突蛋白在细胞膜上的表达水平，引起体液免疫，引发高滴度的针对假病毒的中和抗体，并且安全性高，可用于预防和控制新型冠状肺炎。

技术领域

本发明属于疫苗领域，具体涉及一种新型冠状病毒肺炎DNA纳米疫苗及其制备方法。

背景技术

新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2)是引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)爆发的原因，自2019年末开始疫情在全球持续爆发和持续，造成了巨大的人员伤亡和重大经济损失。面对反复无常的疫情和感染，唯有疫苗才是我们对抗病毒最有效的武器(Vaccine39(2)(2021)197-201)。

SARS-CoV-2的蛋白外壳由刺突蛋白(S)、膜糖蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)、血凝素酯酶二聚体蛋(He)和包膜蛋白(E)组成。S蛋白是一类病毒融合蛋白，介导病毒附着于细胞表面的血管紧张素转换酶2(ACE2)受体，进行膜融合，病毒进入细胞后被核内体吸收。S蛋白的蛋白水解裂解以及病毒膜与核内体膜的融合触发病毒RNA释放到细胞质中(Nat Microbiol5(4)(2020)562-569)。因此，S蛋白是SARS-CoV-2最重要的免疫原性蛋白，可刺激机体产生特异性中和抗体，介导机体的细胞免疫,它是研发SARS-CoV-2疫苗最关键的靶点。

目前，多种SARS-CoV-2候选疫苗正在开发中，主要分为五条技术方向：灭活疫苗、重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗、减毒流感病毒载体疫苗和核酸疫苗(又分为mRNA疫苗和DNA疫苗)五种。最近，中国的灭活疫苗已上市(Cell 182(3)(2020)713)，美国辉瑞公司与德国拜恩泰科公司合作研发的BNT162b1(Interim Report.medRxiv；2020.DOI:10.1101/2020.06.30.20142570.)和美国莫德纳公司研发的mRNA-1273等(N.Engl.J.Med.383(20)(2020)1920-1931。然而，现有的疫苗存在保护周期较短，副反应大和安全性问题，另外，病毒的不断变异，需要开发新型新冠疫苗。

DNA疫苗技术相对成熟，质粒DNA在宿主体内可存在较长时间，抗原基因在体内持续表达产生抗原蛋白，不断刺激机体免疫系统产生长程免疫，免疫效果可靠，基因疫苗不仅可以产生体液免疫应答，而且可以导致细胞毒T淋巴细胞激活而诱导细胞免疫，而传统的疫苗只有活疫苗可诱导细胞免疫，但存在活疫苗毒力回升的危险。DNA疫苗比需要体外培养冠状病毒的灭活疫苗更安全，且灭活疫苗有引起抗体依赖性感染增强(antibody-dependentenhancement of infection,ADE)的风险，抗体增加病毒感染的能力，最终使疾病恶化(Nature Microbiology 5(10)(2020)1185-1191)。与mRNA疫苗相比，DNA更加稳定，是温度稳定和不受冷链限制的，这是输送到资源有限的环境中的重要优势。

基因递送载体是DNA疫苗中的关键部分，主要包括病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体虽然转染效率高，但因其制备与生产困难、具有高免疫原性及包载基因的大小会受到限制等原因，其发展和应用受到了很大限制。非病毒载体主要包括阳离子聚合物和阳离子脂质体，通过与基因的静电相互作用将基因递送到细胞内。其中阳离子聚合物易于合成和改性，无免疫原性，因此可作为良好的基因递送载体，用来制备新型冠状病毒肺炎DNA纳米疫苗，但是同时必须关注其转染效率、稳定性和安全性尤其是避免产生ADE效应等问题。