[发明专利]快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒及制备方法和检测方法

权利要求书

1.快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒，其特征是它包括以下试剂：

a、包含快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒的扩增引物对及探针；

b、含猫疱疹病毒TK基因的阳性对照样品和阴性对照样品；

c、等温核酸扩增试剂盒和快速检测所用的试纸条；

d、所述的核酸扩增试剂盒即重组酶聚合酶等温核酸扩增试剂盒，含有重组酶冻干酶粉、溶解剂、激活剂和ddH₂O。

2.根据权利要求1所述的快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒，其特征是所述的快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒的扩增引物对包括上游引物和下游引物，

上游引物：

ERA-F：5’-TTGAAACTGATGTTGTCGGTGGTATCTATGC-3’，

下游引物：

ERA-R：5’-Biotin-TACAGACCCAAGAGTCATATCACCCACAAAAT-3’。

3.根据权利要求1所述的快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒，其特征是所述的探针为探针：

Probe：

5’-FAM-GTATCTATGCCGTCCAGGACCGGAAACGACGT[THF]GTGAATTATCAGCTG-C3 Spacer-3’。

4.快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒的制备方法，其特征是它包括以下步骤：

步骤一，扩增引物对及探针的制备：在下游引物5’端偶联上生物素；探针5’端偶联上FAM基团，中间位置采用THF（四氢呋喃）替代一个碱基，3’端用C3-间臂基团处理；

步骤二，核酸扩增试剂盒即重组酶聚合酶等温核酸扩增试剂盒，含有重组酶冻干酶粉、溶解剂、激活剂、ddH₂O，为商品化制备；

步骤三，所用的快速检测试纸条：含有抗生物素抗体、抗FAM抗体、抗鼠抗体及金标颗粒；

步骤四，所述的猫疱疹病毒TK基因的阳性对照样品和阴性对照样品均为临床检测获得的样品。

5.快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒的检测方法，其特征是它包括以下步骤：

步骤一，在ERA冻干酶粉中加入20 μL溶解剂，上游引物10 μm和下游引物10 μm各为2.1μL，探针10 μm为0.6 μL，模板2~10 μL，ddH₂O 补充至48 μL，振荡混匀并短暂离心；在反应盖上加2 μL激活剂，短暂离心后37 ℃反应30 min；

步骤二，检测：将步骤一中的反应产物用试纸条检测，2~3 min观察结果；

步骤三，对步骤二中产生的结果判读：采用肉眼观察，

a、阴性：仅在质控线有一条红色条带，在检测线没有红色条带，表明待检样本无猫疱疹病毒感染；

b、阳性：在质控线和检测线均有一条红色条带，表明待检样本中有猫疱疹病毒感染；

c、无效：在质控线和检测线均无红色条带，表明试纸条失效；

步骤四，使用所述的ERA的等温核酸扩增试纸条试剂盒的扩增反应温度为37-40 ℃的水浴锅中进行，反应时间为30 min；反应结束后用横向流动试纸条对扩增产物进行检测；

步骤五，针对的是猫疱疹病毒的TK基因保守区域设计并合成的扩增引物对及探针，与普通PCR引物设计不同，ERA的引物长度为30-35 bp，探针长度为46-52 bp；引物设计时为了避免引物对之间及引物与探针之间形成二聚体结构，因其序列长度的增加也使引物设计及选择的难度增加。

6.根据权利要求5所述的快速检测猫疱疹病毒的ERA核酸试纸条扩增试剂盒的检测方法，其特征是所述的步骤四中使用所述的ERA的等温核酸扩增试纸条试剂盒的扩增反应温度为37℃的水浴锅。