[发明专利]与腐霉利特异性结合的核酸适配体Pr-A08及其应用

说明书

本发明公开了一种与腐霉利特异性结合的核酸适配体Pr‑A08，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，二级结构具有突出的环和茎，且具有G‑四联体结构，吉布斯自由能DG=‑12.18；基于胶体金分光光度法进行核酸适配体特异性、亲和力性质评估，实验结果显示核酸适配体Pr‑A08能特异性与腐霉利结合，具有高特异性、高亲和力的特点，该核酸适配体具有高特异性、高亲和力的特点，其可以应用在核酸适配体在制备识别腐霉利的试剂或在制备检测腐霉利试剂盒中，在降低腐霉利对人体的侵害方面具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种与腐霉利特异性结合的核酸适配体Pr-A08及其应用。

背景技术

腐霉利(procymidone)，化学名为 N-(3, 5-二氯苯基)-1, 2-二甲基环丙烷-1,2-二甲酰基亚胺, 又称速克灵、杀霉利。它易溶于丙酮、氯仿、二甲苯、二甲基甲酰胺，微溶于乙醇，难溶于水。它是一种内吸性杀菌剂，兼有保护和治疗的作用，低温高湿条件下使用效果明显。用于油菜、萝卜、茄子、黄瓜、白菜、番茄、向日葵、西瓜、草莓、元葱、桃、樱桃、花卉、葡萄等作物，防治灰霉病和菌核病及灰星病、花腐病、褐腐病、蔓枯病等，也可用于对甲基硫菌灵、多菌灵有抗性原菌，但菌株容易对其产生抗性。近年来，在蔬菜、水果上使用广泛，也是在各级农产品质量安全监测中农药残留检出率和超标率较高的农药品种之一。在韭菜中的最大残留限量值为0.2mg/kg，植物油为0.5mg/kg, 番茄、黄瓜为2mg/kg，茄子、辣椒、葡萄、蘑菇类(鲜)、鲜食玉米为5mg/kg，草莓为10mg/kg。腐霉利少量摄入体内对人的身体没有影响，但如果长期超标食用，会影响人体健康，轻则刺激眼部和皮肤，重则可能在人体内定量沉积，对人体的神经、血液系统等造成危害。传统检测腐霉利的技术通常是通过气相色谱-质谱法、抗体试纸条法，气相色谱-质谱法需要复杂的仪器设备和昂贵的费用，抗体具有合成周期长不稳定等缺点。

核酸适配体（Aptamer）是一种通过体外配体指数富集系统进化技术（Systematicevolution of ligands by exponential enrichment, SELEX）从人工构建的寡核苷酸文库中筛选出来的一段对靶标物质有高亲和力，并能够特异性识别的单链寡核苷酸序列。适配体可以特定的二维或三维构象结合靶标物质，包括茎环、发夹、G-四链体等结构，以此实现目标物质的检测。适配体的独特优势在于，适配体对靶标物质的特异性强，亲和力高，适配体与目标分子间的解离常数一般为 10^-9~10^-12 mol/L；适配体目标范围广，适配体不仅可与酶、抗体等分子结合，而且也可与金属离子、生物毒素、药物等小分子结合；适配体体外可大量并迅速地化学合成，且易被官能团修饰；适配体分子质量小，一般由 25~100个碱基组成的单链寡核苷酸片段，同时与靶标物质结合时形成的空间位阻小；适配体的稳定性与可复性好，可反复变性复性。由此，借助核酸适配体所具有的优势使得其在分析化学、医学领域以及环境监测和食品安全控制方面有广泛的应用。

发明内容

本发明提供了一种与腐霉利特异性结合的核酸适配体Pr-A08，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示，二级结构具有突出的环和茎，且具有G-四联体结构，吉布斯自由能DG=-12.18。

本发明另一目的是将与腐霉利特异性结合的核酸适配体应用在制备识别腐霉利的探针分子或在制备检测腐霉利试剂盒中。

本发明目的通过以下技术方案实现：

步骤一、筛选

采用SELEX技术通过能够偶联羟基的柱子筛选出能够与腐霉利特异性结合的核酸适配体群体；

步骤二、克隆

设计引物进行PCR扩增、连接转化、挑取单克隆，利用PMD 19-T载体将PCR产物连接转化到感受态细胞中，将连接转化好的感受态细胞通过划线的方法在带有氨苄的培养基平板上，37℃过夜培养，得到单菌落；