[发明专利]一种尼克酰胺磷酸核糖转移酶的提取纯化方法

说明书

本发明公开了一种尼克酰胺磷酸核糖转移酶的提取纯化方法，包括以下步骤：(1)将NAMPT生产菌株进行发酵培养，得到发酵液，离心，收集发酵液中的菌体；(2)向菌体中加入纯水，用氨水调节pH至7.2‑7.4，过均质机后离心，分离得到上清液；(3)将上清液依次经活性炭脱色和陶瓷膜过滤处理，得到滤液；(4)向滤液中加入非离子型去垢剂去除包涵体，得到粗酶液；(5)将粗酶液采用镍柱进行亲和层析，收集洗脱液，洗脱液经电渗析脱盐后浓缩结晶，干燥，即提取纯化得到NAMPT。采用本发明的方法可以从含有尼克酰胺磷酸核糖转移酶的发酵液中将NAMPT有效的提取纯化出来，NAMPT的收率和纯度都有了显著的提高。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种尼克酰胺磷酸核糖转移酶的提取纯化方法。

背景技术

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)在各种细胞生理过程中起着至关重要的作用，对基因表达、DNA修复、钙离子动员、应激、凋亡、代谢、增殖、老化、内分泌等方面表现出深刻的影响，NAD的生物能量状态甚至决定了细胞的生死存亡，因而参与NAD生物合成和代谢的酶也成为各种疾病的药物发现中极具吸引力的靶标。尼克酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase，NAMPT)是NAD补救合成通路的限速酶，通过合成NAD参与细胞物质和能量代谢、蛋白质修饰、DNA修复等重要过程。

因此，NAMPT具有广泛的应用价值，需求量不断增加。目前已有通过基因重组技术表达重组NAMPT酶的报道。但是，由于表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，从生物体中有效分离纯化基因重组蛋白一直是个难题。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种尼克酰胺磷酸核糖转移酶的提取纯化方法。采用本发明的方法可以从含有尼克酰胺磷酸核糖转移酶的发酵液中将NAMPT有效的提取纯化出来，NAMPT的收率和纯度都有了显著的提高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种尼克酰胺磷酸核糖转移酶的提取纯化方法，包括以下步骤：

(1)将NAMPT生产菌株进行发酵培养，得到发酵液，离心，收集发酵液中的菌体；

(2)向菌体中加入纯水，用氨水调节pH至7.2-7.4，过均质机后离心，分离得到上清液；

(3)将上清液依次经活性炭脱色和陶瓷膜过滤处理，得到滤液；

(4)向滤液中加入非离子型去垢剂和氯化钠去除包涵体，得到粗酶液；

(5)将粗酶液采用镍柱进行亲和层析，收集洗脱液，洗脱液经电渗析脱盐后浓缩结晶，干燥，即提取纯化得到NAMPT。

优选的，步骤(1)中，离心速度为4000r/min，离心时间为15min。

优选的，步骤(2)中，过均质机后10000r/min离心20min。

优选的，步骤(4)中，非离子型去垢剂为Triton X-100。

优选的，步骤(4)中，向滤液中加入非离子型去垢剂Triton X-100和氯化钠，使Triton X-100的终质量浓度为2％，氯化钠的终浓度为500mM。

优选的，步骤(5)中，镍柱亲和层析所采用的结合缓冲液为50mM的PBS；洗脱剂为80mM的咪唑磷酸盐缓冲液，流速小于或等于5L/min。

进一步的，步骤(1)中，所述NAMPT生产菌株由如下方法构建而成：