[发明专利]一种检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用

权利要求书

1.一种检测新型冠状病毒的引物探针组合，其特征在于，所述检测新型冠状病毒的引物探针组合包括特异性扩增并检测2019-nCoV的ORF1ab基因、核壳蛋白N基因和刺突蛋白S基因N501Y突变位点的特异性引物对和探针；

扩增所述ORF1ab基因的特异性引物对为SEQ ID No.1~2所示的核苷酸序列，检测所述ORF1ab基因的探针为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；

扩增所述核壳蛋白N基因的特异性引物对为SEQ ID No.4~5所示的核苷酸序列，检测所述核壳蛋白N基因的探针为SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；

扩增所述刺突蛋白S基因N501Y突变位点的特异性引物对为SEQ ID No.7~8所示的核苷酸序列，检测所述刺突蛋白S基因N501Y突变位点的探针为SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；

所述检测新型冠状病毒的引物探针组合还包括特异性扩增并检测内标基因RNaseP的特异性引物对和探针；

扩增所述内标基因RNaseP的特异性引物对为SEQ ID No.10~11所示的核苷酸序列，检测所述内标基因RNaseP的探针为SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；

所述探针的5’端标记荧光发生基团；

所述探针的3’端标记荧光淬灭基团；

检测所述ORF1ab基因的探针的5’端的荧光发生基团为FAM，3’端的荧光淬灭基团为MGB；

检测所述核壳蛋白N基因的探针的5’端的荧光发生基团为HEX，3’端的荧光淬灭基团为MGB；

检测所述刺突蛋白S基因N501Y突变位点的探针的5’端的荧光发生基团为ROX，3’端的荧光淬灭基团为MGB；

检测所述内标基因RNaseP的探针的5’端的荧光发生基团为Cy5，3’端的荧光淬灭基团为MGB。

2.一种检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述检测新型冠状病毒的试剂盒包括权利要求1所述的检测新型冠状病毒的引物探针组合；

所述检测新型冠状病毒的试剂盒还包括PCR缓冲液和酶混合液。

3.根据权利要求2所述的检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增并检测ORF1ab基因、核壳蛋白N基因和刺突蛋白S基因N501Y突变位点的特异性引物对和探针的使用浓度独立地为180~220 nM；

所述特异性扩增并检测内标基因RNaseP的特异性引物对和探针的使用浓度独立地为80~120 nM；

所述PCR缓冲液包括26~30 mol/L Tris-HCl、15~25 mmol/L (NH₄)₂SO₄、28~32 mmol/LKCl、3.5~4.5 mmol/L MgCl₂和0.15~0.25 mol/L dNTPs；

所述酶混合液包括3~8 U热启动Taq酶、3~8 U逆转录酶和0.05~0.2 U尿嘧啶糖基化酶。

4.根据权利要求2所述的检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述检测新型冠状病毒的试剂盒还包括空白对照和阳性对照；

所述空白对照为无RNA酶的水；

所述阳性对照为(0.8~1.2)×10⁵ copies/mL的2019-nCoV ORF1ab基因假病毒、(0.8~1.2)×10⁵ copies/mL的2019-nCoV核壳蛋白N基因假病毒和(0.8~1.2)×10⁵ copies/mL的2019-nCoV刺突蛋白S基因假病毒和(0.8~1.2)×10⁴ copies/mL的内标基因RNaseP假病毒。

5.一种权利要求2~4任一项所述的检测新型冠状病毒的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括：

提取待测样本核酸，加入检测新型冠状病毒的引物探针组合、PCR缓冲液和酶混合液进行qPCR检测，使用空白对照和阳性对照进行同步qPCR检测，根据扩增曲线和反应Ct值对结果进行判断。