[发明专利]一种检测样本中目标序列整合和突变的方法及其引物的设计方法和试剂盒

权利要求书

1.一种检测样本中目标序列整合和/或突变的方法，其特征在于，其包括：获取待测样本中的cfDNA，在cfDNA片段的两端添加带有标签的环化接头，并将添加环化接头的cfDNA片段环化；

以目标序列为模板设计多组背靠背引物，多组所述背靠背引物分别与所述目标序列上不同的目标区域互补，每组背靠背引物均包括前导链引物和后随链引物，所述前导链引物和所述后随链引物的扩增方向相反，且所述后随链引物与所述目标序列互补的区域位于所述前导链引物与所述目标序列互补的区域的上游；

将多组所述背靠背引物分为两个或两个以上的引物池，使得每个引物池中相邻两组背靠背引物对应的目标区域之间的间隔距离≥所述引物池的个数ⅹ(45～75)；

采用两个或两个以上的所述引物池分别单独地对环化后的cfDNA片段进行环化扩增，并对扩增后的产物进行测序分析。

2.根据权利要求1所述的检测样本中目标序列整合和/或突变的方法，其特征在于，所有背靠背引物对应的目标区域的总覆盖率占所述目标序列总长的50％以上；

优选地，所述总覆盖率占所述目标序列总长的80％以上；

优选地，当所述目标序列为具有多个亚型的序列时，每组所述背靠背引物中，所述前导链引物和/或所述后随链引物的条数≥2，以使该组背靠背引物能够对同一区域的不同亚型进行扩增检测。

3.根据权利要求1所述的检测样本中目标序列整合和/或突变的方法，其特征在于，cfDNA片段环化的方法如下：在样本中添加辅助成环序列，以使添加有环化接头的cfDNA片段环化；

所述环化接头包括有相互连接的标签序列和接头序列，当环化接头连接于cfDNA序列两端时，所述接头序列通过所述标签序列与cfDNA片段相连；

所述辅助成环序列上具有能够分别与2段接头序列互补配对的第一结合区域和第二结合区域，当第一结合区域与所述第二结合区域分别与所述cfDNA片段两端的接头序列相连时，所述cfDNA片段成环状。

4.根据权利要求1～3任一项所述的检测样本中目标序列整合和/或突变的方法，其特征在于，在环化扩增后，测序分析前，所述方法还包括对环化扩增产物两端添加测序接头；

在所述测序分析中，序列的起止点和标签相同的多个扩增产物被认为是重复的，只进行一次计数；

优选地，所述测序分析包括：去除扩增产物的测序接头后，根据序列之间的重叠部分将序列进行组装，随后根据引物的位置信息、标签以及环化接头，对组装的序列进行重构；

将重构后的序列比对至参考序列和参考基因组的集合；基于对比信息，获得待测样本中初始cfDNA模板序列；

优选地，在进行组装前，所述方法包括对扩增产物进行低质量reads过滤。

5.根据权利要求4所述的检测样本中目标序列整合和/或突变的方法，其特征在于，当检测样本中目标序列的整合时，所述测序分析还包括：将所有初始cfDNA模板序列比对至所述参考序列和所述参考基因组的集合，并基于比对信息对cfDNA模板序列进行过滤：

将初始cfDNA模板序列上能够比对至所述参考序列上的区域标记为第一区域，能够比对至所述参考基因组上的区域标记为第二区域；

只保留同时具有所述第一区域和所述第二区域且所述第一区域和所述第二区域的长度≥50bp的cfDNA模板序列，用于获取整合位点；

优选地，对cfDNA模板序列进行过滤时，还包括基于比对信息进行筛选，只保留cigar信息为S/M的cfDNA模板序列，用于获取整合位点；

优选地，所述方法还包括对检测获得的整合位点进行过滤，若一条cfDNA模板序列上的所述第一区域和所述第二区域在交界处存在重叠，则将该重叠的部分视为归属于第一区域，用于判断获取最终的整合位点。

6.根据权利要求4所述的检测样本中目标序列整合和/或突变的方法，其特征在于，当检测目标序列的突变时，所述测序分析还包括：将所有初始cfDNA模板序列与所述参考序列进行比对，并基于对比结果和测序信息对检测得到的初始突变位点进行过滤：

若初始突变位点的测序深度小于10ⅹ，则去除该位点，反之则保留；

若初始突变位点的VAF为1且群体基因频率大于0.9，则去除该位点，反之则保留。