[发明专利]鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒的多重PCR检测试剂盒

权利要求书

1.一种鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒的多重PCR检测试剂组合，其特征在于，包括针对鸭坦布苏病毒的引物、针对新型鸭呼肠孤病毒的引物、针对新型鹅细小病毒的引物、DreamTaq Green PCR 预混液、谷氨酰胺和扩增促进剂，各类引物的序列如下：

针对鸭坦布苏病毒(DTMUV)的引物：

上游：5’-GCAGGGTTTGAAGCTGAAAG-3’；

下游：5’-CCCACTTCTATGCCACTGGT-3’；

针对新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的引物：

上游：5’-TCGTCACTACTGTCAAGCTC-3’；

下游：5’-TATGTATGAGAGGAGCCACA-3’；

针对新型鹅细小病毒(NGPV)的引物：

上游：5’-GGCTCACTGAGAACCGAGAC-3’；

下游：5’-AGACCCTCCCAAAATTGCTT-3’。

2.根据权利要求1所述的一种鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒的多重PCR检测试剂组合，其特征在于，所述扩增促进剂的制备方法为：硝酸铈加入去离子水中配成硝酸铈的水溶液，将所述硝酸铈的水溶液水浴恒温至90±5℃的温度范围内，然后加入甘氨酸和蛋氨酸，加料完成后搅拌溶液3h以上，然后在90±5℃的温度范围内蒸干液相，所得固相为所述扩增促进剂。

3.根据权利要求2所述的一种鸭坦布苏病毒、新型鸭呼肠孤病毒、新型鹅细小病毒的多重PCR检测试剂组合，其特征在于，所述硝酸铈的水溶液中，硝酸铈的浓度为0.1～0.2mol/L，其余为水；所述甘氨酸和蛋氨酸的加入量与所述硝酸铈的水溶液的比例为甘氨酸：蛋氨酸：硝酸铈的水溶液=2～4g:1～5g:100mL。

4.如权利要求1～3任一项所述多重PCR检测试剂组合的使用方法，其特征在于，向所述DreamTaq Green PCR 预混液中加入所述鸭坦布苏病毒的引物、新型鸭呼肠孤病毒的引物、新型鹅细小病毒的引物，然后加入DTMUV cDNA、NDRV cDNA、NGPV DNA，再用灭菌水调节至反应所需总体积，使得其中鸭坦布苏病毒的上、下游引物的浓度各为0.5μM，新型鸭呼肠孤病毒的上、下游引物的浓度各为1.0μM，新型鹅细小病毒的上、下游引物的浓度各为0.1μM；然后再加入谷氨酰胺和扩增促进剂，进行扩增反应。

5.如权利要求1～3任一项所述多重PCR检测试剂组合进行的不以疾病诊断治疗为目的的病毒检测方法，其特征在于，步骤包括：

1) 按照TIANamp Virus DNA/RNA Kit方法提取NDRV及DTMUV的RNA，NGPV的 DNA；

2) 将NDRV、DTMUV的RNA反转录成cDNA；

3) 利用所述多重PCR检测试剂组合对所述病毒DNA和cDNA进行扩增；

4) 判断临床样品是否为NDV、DPV、DTMUV的单一感染或混合感染。

6.根据权利要求5所述的病毒检测方法，其特征在于，所述步骤2)的反转录反应条件为：用HiScriptⅡ Reverse Transcriptase试剂盒对所述RNA进行反转录：采用50 μL体系，于EP管中依次加入RNA模板5μL、5×HiScriptⅡ Buffer 10μL，随机引物2μL、dNTP Mix2.5mM each 4μL、HiScriptⅡReverse Transcriptase 200U/μL 1μL, RNase inhibitor40U/μL 2μL，补充RNase-free ddH₂O至总体积共50μL，置于PCR仪中进行cDNA合成，以25℃5min、50℃ 45 min、85℃ 2 min、4℃ 5min的程序进行一个循环。