[发明专利]一种从头合成黄烷酮的三功能酶及其合成方法和应用

权利要求书

1.一种从头合成黄烷酮的三功能酶，其特征在于：所述三功能酶的氨基酸序列如SEQID NO.5所示。

2.一种权利要求1所述从头合成黄烷酮的三功能酶的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、从大豆中克隆4-香豆酰辅酶A连接酶基因4CL1和查尔酮异构酶基因CHI、从高粱中克隆查尔酮合酶基因CHS2至原核表达载体pET-32a-SUMO，构建重组质粒pET-32a-SUMO-4CL1-(GGGGS)₂-CHS2-(GGGGS)₂-CHI；克隆4CL1基因时，设计一对PCR引物：正向引物为5’-GAACAGATTGGTGGTGGATCCATGGCACCTTCTCCACAA-3’；

反向引物为5’-CGACCCACCTCCGCCCGACCCACCTCCGCCACTAGTATTGGCCACCACCAAACC-3’；

克隆CHS2基因时，设计一对PCR引物：

正向引物为5’-GGCGGAGGTGGGTCGGCTAGCATGGCCGGCGCGACTGTG-3’；

反向引物为5’-ACTGCCCCCGCCACCCGATCCCCCGCCACCGGATCCGGCGGTGATGGCCGCTCCG-3’；

克隆CHI基因时，设计一对PCR引物：

正向引物为5’-GGTGGCGGGGGCAGTGAATTCATGGCAACGATCAGCGCG-3’；

反向引物为5’-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGACTATAATGCCGTGGC-3’；

步骤2、将重组质粒pET-32a-SUMO-4CL1-(GGGGS)₂-CHS2-(GGGGS)₂-CHI转化大肠杆菌表达株,经IPTG诱导、表达，纯化得到重组酶蛋白。

3. 根据权利要求2所述一种从头合成黄烷酮的三功能酶的合成方法，其特征在于，所述步骤2中，将重组质粒pET-32a-SUMO-4CL1-(GGGGS)₂-CHS2-(GGGGS)₂-CHI转化大肠杆菌表达株Rosetta(DE3),在16℃条件下由0.05 mM IPTG诱导表达12h，离心收集大肠杆菌，采用细菌裂解缓冲液重悬菌体，经超声破碎后，用镍琼脂糖凝胶纯化重组蛋白。

4.一种权利要求1所述三功能酶在生物催化4-香豆酸合成黄烷酮中的应用，其特征在于，所述应用为体外酶促合成黄烷酮。