[发明专利]一种反转录多重套式PCR检测引物

说明书

本发明属于基因型检测技术领域，公开了一种反转录多重套式PCR检测引物，引物包括两条外引物和三条内引物，外引物扩增YHV‑1和YHV‑8的目的基因，产生目的条带；三条内引物搭配分别特异性的扩增YHV‑1和YHV‑8，产生两种目的条带。本发明可灵敏的检测黄头病毒的致病基因型YHV‑1和YHV‑8，并通过产物大小鉴别两种基因型，用于制备上述病毒的鉴别、检测、监测等所需的反转录多重套式PCR的试剂或试剂盒，为该病毒的临床检测和流行病学研究提供了简便、可靠的技术支持。

技术领域

本发明属于基因型检测技术领域，涉及一种反转录多重套式PCR检测引物。

背景技术

对虾是世界公认的高品质水产品，为我国创造了可观的经济效益，同时也是国民优质的食物蛋白源。对虾黄头病是由黄头病毒(Yellow head virus,YHV)引起的传染性疾病，一般影响养殖50天～70天的对虾，感染后3～5天发病率高达100％，死亡率达80％～90％。感染的病虾有一个食量大增然后突然停止的过程，一般在2天～4天出现停食、头胸部发黄和全身发白，肝胰腺变软并由褐色变成黄色。许多濒死虾聚集在池塘角落水面，在短期内大量死亡。

黄头病毒属于套式病毒目、杆套病毒科、头甲病毒属，目前已知有10个基因型，其中YHV-1和YHV-8是经证实导致对虾发病的致病基因型，另外8个基因型(2型～7型、9型、10型)，极少或从不引起疾病，且尚未有在我国养殖对虾中流行的报道。因此，在对虾养殖业实际的疫病监测和流行病学调查中，灵敏地检测和鉴定黄头病毒致病基因型YHV-1和YHV-8对于疫病防控以及病原学研究具有重要的意义。

目前，已报道YHV的PCR检测方法：针对YHV-1的反转录PCR方法(Wongteerasupayaet al.1997)，针对YHV-1和YHV-2的反转录多重套式PCR方法(Cowley et al.2004)，针对IHHNV、WSSV、YHV和TSV的反转录多重PCR方法(乌日琴等，2011)以及一种同时检测对虾IMNV、YHV和TSV的多重PCR检测引物及试剂盒(CN105567875A)。上述4种方法主要针对黄头病毒的致病基因型YHV-1，在YHV-8基因组上无与上述4种PCR引物完全结合的靶序列，因此对YHV-8基因型的检测灵敏度不够，检出率偏低。同时，因为引物设计的局限，上述方法都无法实现对YHV-1和YHV-8的鉴别。同样，已有的基于等温扩增和基因芯片技术的YHV检测方法也存在上述问题，即对YHV-8的检出率偏低，无法对两个基因型进行鉴别。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)现有的检测方法建立时间较早，引物是针对早期发现的黄头病毒致病基因型YHV-1，不能满足对新的致病基因型YHV-8的高灵敏度检测。

(2)现有的检测方法无法实现对黄头病毒致病基因型YHV-1和YHV-8的鉴别。

解决以上问题及缺陷的难度为：需根据目前已知的黄头病毒基因型YHV-1和YHV-8的基因序列，重新设计特殊的引物组合，并对反应的体系以及反应的程序进行优化，满足对两种致病基因型高灵敏度的一步反转录多重套式PCR检测，同时通过扩增产生的产物分子量大小来实现对两种基因型的快速鉴别。

解决以上问题及缺陷的意义为：用一种反转录多重套式PCR引物，同时实现对已知黄头病毒致病基因型YHV-1和YHV-8的高灵敏度检测，通过反应的产物分子量大小快速鉴别样品感染的基因型，为养殖业中疫病的防控和病原学研究提供了技术保障。该鉴定方法不仅准确，而且降低了反应的成本和反应时间。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种反转录多重套式PCR检测引物。该引物可灵敏的检测黄头病毒的致病基因型YHV-1和YHV-8，并可以通过产物大小快速鉴别两种基因型，为该病毒的临床检测和流行病学研究提供了简便、可靠的技术支持。该方法不仅结果准确，而且节省了时间和反应成本。