[发明专利]苹果黄蚜Tre基因及其核酸干扰剂制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种苹果黄蚜Tre基因及其核酸干扰剂制备方法与应用。Tre基因为苹果黄蚜的致死基因，核酸干扰剂配方为包含根据苹果黄蚜Tre基因合成的dsRNA、昆虫体壁渗透剂脂肪醇聚氧乙烯醚(JFC)、氮酮与乳化剂NP‑10。其制备方法包括引物设计、基因扩增、纯化、dsRNA合成、制剂配制等。本发明的苹果黄蚜致死基因与海藻糖酶的活性有关，根据苹果黄蚜该基因合成的RNA干扰剂可抑制海藻糖酶的活性，使得苹果黄蚜血糖代谢受阻，最终导致苹果黄蚜死亡。可喷洒使用Tre基因核酸干扰剂应用于苹果生产中防治苹果黄蚜，具有较高的田间可操作性、杀虫特异性、对天敌及哺乳动物无害、杀虫效率高、对环境友好等优势。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种苹果黄蚜Tre(Trehalase)基因及其应用、核酸干扰剂及其制备方法与应用。

背景技术

苹果黄蚜是我国苹果产区危害严重的叶面害虫，其在刺吸危害的同时还可传播植物病毒病，诱发果树发生多种病害，其排出的蜜露覆盖于叶面及果实，诱发叶片霉污病，严重影响叶片的光合作用和果品质量。目前，使用化学农药仍是控制苹果黄蚜的主要方法，但高强度的农药选择压力逐渐加剧了其抗药性的发展、“3R”问题日益突出，果品农残超标率居高不下，不仅影响果品出口，增加害虫治理成本和难度，还严重影响生态安全。因此，开发对环境友好的可持续的苹果黄蚜治理策略已成当务之急。开发基于RNAi的苹果黄蚜绿色防控新技术是解决上述问题的新策略。

RNA干扰(RNAi)是一种转录后基因沉默现象，是指内源性或外源性与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA在细胞内特异降解该mRNA，从而使相应基因沉默，达到阻止基因表达的目的，现已被国际上公认为“第四代杀虫剂”核心技术。目前对昆虫进行RNAi主要是通过注射和饲喂dsRNA的方式，但是这两种方式很难应用到生产实践中，由于昆虫体壁的阻挡，单独喷洒dsRNA分子对害虫无效，因此，开发可喷洒使用的具有触杀作用的dsRNA制剂尤为重要。根据苹果黄蚜致死基因及基因沉默技术原理，开发可喷洒使用的基因干扰制剂，对苹果黄蚜进行高效、绿色、精准防控。该技术对防治苹果黄蚜具有特异性，对天敌及其他哺乳动物无害，不污染环境，大幅降低果园化学农药的使用，保障果品品质及食品安全。

发明内容

为解决现有技术的缺点和不足，本发明要解决的技术问题是苹果克服现有RNAi害虫防治技术的不足，提供一种苹果黄蚜致死基因及其应用、核酸干扰剂及核酸干扰剂的制备方法和应用，苹果黄蚜致死基因与海藻糖酶的活性有关，根据致死基因设计dsRNA可以抑制海藻糖酶的活性，使得苹果黄蚜的血糖代谢受阻，最终导致苹果黄蚜死亡。将合成的dsRNA与昆虫体壁渗透剂脂肪醇聚氧乙烯醚(JFC)、氮酮、NP-10混配，将其制备成可喷洒使用的核酸干扰剂，可以对苹果黄蚜进行高效精准防治，具有杀虫特异性强、环境友好、防效高等优势。

为实现上述目的，本发明提供了一种苹果黄蚜Tre(Trehalase)基因，所述Trehalase基因为苹果黄蚜致死基因，所述Trehalase基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。通过提取苹果黄蚜的总RNA，反转录合成cDNA第一条链，以第一条链为模板，设计上下游引物对Trehalase的cDNA片段进行PCR扩增。

进一步的，所述上游引物DNA序列为CATGAACATATTCTTGGAAAT；下游引物DNA序列为：ATTTCCAAGAATATGTTCATG。

基于一个总的构思，本发明还提供了一种苹果黄蚜Trehalase基因在防治苹果黄蚜中的的应用。

基于一个总的构思，本发明还提供了一种核酸干扰剂，所述核酸干扰剂的主效成分为dsTrehalase(dsRNA)，所述dsTrehalase为权利要求1所述的Trehalase基因的cDNA片段合成的特异性dsRNA，所述dsTrehalase的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

基于一个总的构思，本发明还提供了一种核酸干扰剂的制备方法，包括以下步骤：