[发明专利]一种鸡感染空肠弯曲杆菌的分子标记及检测方法和应用

说明书

本发明公开了一种鸡感染空肠弯曲杆菌的分子标记及检测方法和应用，该分子标记为鸡盲肠组织gga‑miR‑24‑3p的异构体isomiR‑1，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。通过以鸡盲肠组织总RNA反转录的DNA为模板进行PCR扩增，经内参校正后，待检鸡isomiR‑1的表达量超过阴性鸡6倍以上则判定为空肠弯曲杆菌阳性鸡。本发明通过检测鸡盲肠组织gga‑miR‑24‑3p异构体isomiR‑1的表达水平，以确定其是否已感染空肠弯曲杆菌，是一种新型的分子标记方法。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种鸡感染空肠弯曲杆菌的分子标记及检测方法和应用。

背景技术

空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)为革兰氏阴性菌，微需氧(5％氧气、10％二氧化碳、85％氮气)，是弯曲杆菌属的一个种，鸡是空肠弯曲杆菌的主要宿主，不仅能引起畜禽发病，造成畜牧业严重的经济损失，而且也是人类食源性疾病的主要病原菌之一，是一种人畜共患病原菌。

microRNA(miRNA)是一类短小、单链、非编码RNA，长度大约20～24nt，广泛存在于动物、植物、病毒体内。同一个miRNA前体可能由于Drosha或Dicer的剪切位点改变，外切核酸酶介导的miRNA端缩短，miRNA编辑等多种原因，而形成多种长度或序列不同的miRNAs异构体—isomiR。能够在转录后水平对基因表达进行更精细的调控。由于isomiR与其注释体通常只有少数碱基的差异，目前常规检测miRNA的加尾法和茎环法都不能很好地分辨这种差异，为isomiR的检测和在抗病育种中的应用造成很大困难。

前期研究发现，鸡感染空肠弯曲杆菌后，gga-miR-24-3p的其中一个异构体isomiR-1显著上调，且基础表达量高于其他异构体，适合作为一种内源生物标志物。通过检测鸡盲肠组织gga-miR-24-3p异构体isomiR-1的表达水平，以确定其是否已感染空肠弯曲杆菌，是一种新型的分子标记方法，能够克服传统微生物检测方法灵敏度低、难以确定是否内源污染的缺点，实现快速、高效地对空肠弯曲杆菌感染状况进行监控，适用于家禽遗传育种研究，在抗病育种领域具有潜在应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测鸡感染空肠弯曲杆菌的分子标记，通过检测鸡盲肠组织内特异性gga-miR-24-3p异构体isomiR-1的表达水平以确定鸡是否感染空肠弯曲杆菌，在家禽抗病育种领域具有潜在应用价值。

为了实现上述技术目的，本发明具体采用以下技术方案：

一种鸡感染空肠弯曲杆菌的分子标记，该分子标记为鸡盲肠组织gga-miR-24-3p的异构体isomiR-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述gga-miR-24-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的另一方面，提供了一种检测鸡感染空肠弯曲杆菌的方法，包括以下步骤：

1)提取鸡盲肠组织总RNA，进行反转录；

2)以反转录的DNA为模板，分别利用检测引物和内参引物进行PCR扩增；

3)经内参校正后用方法计算待检鸡和阴性鸡isomiR-1的差异倍数，待检鸡isomiR-1的表达量超过阴性鸡6倍以上判定为空肠弯曲杆菌阳性鸡。

进一步的，所述反转录引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步的，所述检测引物如SEQ ID NO.4～5所示，所述内参引物如SEQ ID NO.6～7所示。

进一步的，所述PCR体系为：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0μl，上下游引物各0.4μl，Template DNA 2.0μl，ddH₂O 7.2μl。