[发明专利]一种检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒，其特征是，包括AILTV-反应液、DNA酶混合液、AILTV-内标、AILTV-阳性对照和AILTV-阴性对照；

所述AILTV-反应液包括PCR-Buffer、dNTP、引物、引物探针、内标引物和内标探针；

所述dNTP包括dATP、dUTP、dGTP和dCTP；

所述引物包括：

上游引物的序列为5’-CATCAACTTGAACGCCACT-3’；

下游引物的序列为5’-CCAGTATCTCTGAGTTCCTCG-3’；

引物探针为5’-Fam-ATACTTCGACGGGCACAAAGTCC-BHQ1-3’，Fam为报告荧光基团，BHQ1为淬灭荧光基团；

所述内标引物包括：

内标上游引物，序列为5’-CATAGTTGGACCGCTAGGA-3’，

内标下游引物，序列为5’-GAAAGGTCCCGCAAAGAGT-3’，

所述内标探针为5’-Hex-CCGGTGATAAACCTTTGGACCCT-BHQ1-3’，Hex为报告荧光基团，BHQ1为淬灭荧光基团。

2.如权利要求1所述的检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒，其特征是，DNA酶混合液中包括酶稀释液、热启动Taq酶与UNG酶。

3.如权利要求1所述的检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒，其特征是，所述AILTV-内标为连接有随机的内标核苷酸序列的重组质粒，浓度为1.0×10³～2.0×10³copies/μL，随机的内标核苷酸序列为：

CTGGAGACTGAGGGTTGACGCGCATTCGTCATTGAACGCAGACACGGCTGAGAGAACATGGAGCGACTGCACTGCACTTGGTCGATCTGATTAGGAGTGGGGTTTATGCCCGCGGCTTATCCCCCTATCCTTGCGACACGGGAGAAGACAGATTGTCATCGATTTCGCAAGCCATGATATGTTTGGCCCGACCAACCGCGTTTTTCTCGCGCTTGGATAACGACCTATGGTGTGGACAGTGGCTTAGAGGACATGACACGACGGGCTGAAAGTATGTGGTGCTGGGGCCCTTAGATAGCTGCATAGTTGGACCGCTAGGAATTATATCAATTCGAGATCTCCAGCCGACAAAGTAGGCTCCTAACTAACAGGGTCCAAAGGTTTATCACCGGTCCTTACTCTTTGCGGGACCTTTCTACCCATACAATATCGTCCTCCGATGATGGATCACGGAG。

4.如权利要求1所述的检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒，其特征是，所述AILTV-阳性对照为连接有目标核苷酸序列的重组质粒，Ct值为17.0-41.0，目标核苷酸序列为：CATCAACTTGAACGCCACTATACTAGAAGATTTGGACTTTGTGCCCGTCGAAGTATACACTCGCGAGGAACTCAGAGATACTGG。

5.如权利要求1所述的检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒，其特征是，AILTV-阴性对照为用DEPC H₂O配制的TE缓冲液。

6.如权利要求1所述的检测禽传染性喉气管炎病毒的试剂盒，其特征是，各组分的含量为：

7.一种检测禽传染性喉气管炎病毒的检测方法，其特征是，包括如下步骤，

(1)样品采集；

(2)样品预处理；

(3)扩增试剂配制：取出除DNA酶混合液外的各组分，室温放置，待其彻底溶解后，震荡混匀备用；按比例取相应量的试剂，充分混匀成PCR-Mix，离心；

(4)加样：向每个反应管中分别加入PCR mix和样品，离心，转移至扩增区；

(5)上机扩增：将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及待测样本；选择FAM通道检测禽传染性喉气管炎病毒核酸；选择HEX通道检测内标；循环参数设定如下：

(6)结果分析与判定：待反应程序完成后，记录样品Ct值与扩增曲线；AILTV-阴性对照HEX通道Ct值≤35，FAM通道无报告Ct值；AILTV-阳性对照HEX通道Ct值≤35，FAM通道Ct值≤35；被检样品检测结果中HEX通道Ct值≤35且FAM通道Ct值≤35，报告为AILTV核酸阳性；被检样品检测结果中HEX通道Ct值≤35且FAM通道Ct值40或无报告Ct值，报告为AILTV核酸阴性；被检样品检测结果中HEX通道Ct值≤35且FAM通道35≤Ct值＜40，报告可疑，应重新进行检测，如复检无Ct值，则报告AILTV核酸检测阴性，反之为AILTV阳性；被检样品检测结果中FAM通道Ct值40或无报告Ct值，同时HEX通道Ct值35，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，对此样本进行重复实验。