[发明专利]一种用于恙虫病东方体TSA蛋白诱导表达及大量纯化的方法

说明书

本发明属于生物工程技术领域，尤其是一种用于恙虫病东方体TSA蛋白诱导表达及大量纯化的方法，解决了现有技术中尚无较好的体外诱导以及大量表达恙虫病东方体相关蛋白的方法和相适应的条件的问题，所述用于恙虫病东方体TSA蛋白诱导表达及大量纯化的方法，包括引物合成、目的基因的获取与扩增、重组表达质粒的构建、恙虫病东方体相关蛋白的诱导表达、Western blot试验、重组蛋白表达形式分析、重组蛋白纯化等步骤。本发明设计了一种恙虫病东方体TSA蛋白获取的方法，通过探索调整蛋白诱导表达条件及蛋白纯化方法，成功体外诱导表达恙虫病东方体相关TSA蛋白，同时提高体外蛋白的纯度。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种用于恙虫病东方体TSA蛋白诱导表达及大量纯化的方法。

背景技术

恙虫病是一种自然疫源性疾病，又称丛林性斑疹伤寒，由专性细胞内细菌恙虫病东方体引起的一种容易被忽略的潜在的致命感染性疾病，恙虫病每年发生100万余例，已有研究发现，恙虫病如果没有接受及时的治疗，病死率的发生很可能大于登革热而达到10%的病死率，尤其在患者还未接受抗生素治疗的时候，该病的死亡率甚至可以高达40%-45%。

恙虫病东方体寄生于恙螨，人被恙螨叮咬后，在人体血管内皮细胞生长、繁殖，其潜伏期一般为7-21天，临床表现主要有寒战、发热等非特异性症状，重症感染表现为感染性休克、弥散性血管内凝血甚至死亡。而恙虫病由于起病初期的非特异性症状很难与其他发热性疾病如发热伴血小板减少综合征、流行性出血热等疾病鉴别，所以，目前对于恙虫病相关致病机制的研究报道几乎依旧处于空白领域。虽然随着研究的不断深入，PCR和血清学检测及敏感抗生素的治疗得以发展，但快速准确的高敏感性和特异性的诊断方法及疫苗的研究依旧具有重要的意义。

恙虫病患者的早期诊断和治疗对于改善疾病的预后至关重要，因此建立快速且准确的恙虫病诊断方法至关重要，而恙虫病患者的血清已经被证明可以与几种恙虫病主要抗原反应，包括主要外膜56-kDa（TSA）蛋白，它占立克次体细胞蛋白总含量的10- 15%以及其他次要蛋白，如22-kDa、47-kDa和110-kDa蛋白等，而由于56-kDa型特异性抗原(TSA)位于恙虫病立克次体表面的免疫显性。已有研究发现56kDa（TSA）蛋白是一种免疫显性的抗原，具有群体特异性和菌株特异性的表位，可以与单克隆抗体发生反应，虽然其抗原多样性与不同菌株的分子变异程度有关，但是，大多数恙虫病患者的血清可以识别TSA蛋白，因此TSA蛋白被认为是合适的诊断性抗原和候选疫苗。

现阶段对于恙虫病东方体56kDa蛋白对机体的致病机制的研究人员较多，但是如何稳定于体外获得纯度较高的恙虫病东方体相关蛋白一直是一个难点，目前尚无较好的体外诱导以及大量表达恙虫病东方体相关蛋白的方法和相适应的条件。基于上述陈述，本发明提出了一种用于恙虫病东方体TSA蛋白诱导表达及大量纯化的方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中尚无较好的体外诱导以及大量表达恙虫病东方体相关蛋白的方法和相适应的条件的问题，而提出的一种用于恙虫病东方体TSA蛋白诱导表达及大量纯化的方法。

一种用于恙虫病东方体TSA蛋白诱导表达及大量纯化的方法，包括以下步骤：

（1）引物合成：参照GenBank及所需要的酶切位点设计恙虫病东方体TSA致病蛋白引物1-30条，共计30条引物，采用overlapPcr方法合成该蛋白序列全长。

（2）目的基因的获取与扩增：合成恙虫病东方体TSA蛋白，PCR扩增TSA蛋白全长序列，依次进行全长PCR一轮、全长PCR二轮反应，反应完成后，将全长PCR二轮产物经1%琼脂糖凝胶电泳，回收TSA目的片段备用；