[发明专利]一种基于FLOS-LAMP检测大西洋鲑鱼的试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种基于FLOS‑LAMP检测大西洋鲑鱼的试剂盒及方法。本发明基于大西洋鲑鱼细胞色素b基因筛选了4条特异性引物，同时设计了1条环引物并在其3’末端倒数第2个碱基标记荧光探针。该探针与靶标特异性结合释放荧光信号，可以避免检测到由引物二聚体、发夹结构等造成的假阳性信号。本方法灵敏度高、特异性强，最低检测限可达5pg/μL。

技术领域

本发明涉及一种基于FLOS-LAMP技术检测大西洋鲑鱼的引物组、试剂盒及方法，属于分子生物学检测技术领域。

背景技术

大西洋鲑鱼(Salmo Salar)属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲑形目(Salmoniformes)、鲑鱼科(Salmonidae)，是一种高价值的经济鱼类。其较少以鲜活的形式出售，多以冰鲜切片或罐头、鱼干等制品出现在市场上。消费者无法直接对经过多重工艺处理后的鱼肉制品进行区分，这给不法商贩带来了可乘之机。为了获取高额的利润，常有用价格低廉的品种进行替换或掺入原料进行生产的情况发生。这种以次充好、掺假造假的违法行为不仅扰乱了市场秩序，更可能会导致严重的食品安全问题。为此，建立快速准确的大西洋鲑鱼鉴定技术尤为关键。

基于DNA的检测方法在食品鉴伪方面已成为研究热点。黄曼虹等分别基于线粒体CO I和Cyt b基因设计大西洋三文鱼和虹鳟鱼特异性引物，通过对引物特异性验证及反应体系优化，建立了一种双重荧光PCR快速鉴定方法，可以从干鱼制品、冷冻制品、罐头等多产品中有效鉴定大西洋三文鱼和虹鳟鱼。王楠建立了以CO I为主要靶标，16S rRNA为辅助靶标的基于Sanger测序的DNA条形码技术，对鲑鱼类混合鱼样进行高通量测序，可检测出低至1％含量的物种。将该技术应用于32份市售鲑科鱼类食品的物种鉴别，发现53.13％鲑科鱼加工制品中检出标签中未标识的物种，这表明了市场上存在较为严重的掺杂掺假现象。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method，LAMP)于2000年由日本学者Notomi等研发而得，与常规PCR方法相比，其具有快速检测、操作简单、高灵敏度、高特异性等优点，更适合现场实地检测。 LAMP的基本原理是在恒温(60℃-65℃)条件下，4-6条特异性引物(外引物 F3/B3，内引物FIP/BIP，环引物Loop F/Loop B)通过特异性识别处于解链状态下的目标双链DNA上的6-8个区域，在具有链置换作用的BstDNA聚合酶的作用下通过碱基互补进行DNA合成。LAMP扩增包括哑铃状模板合成和循环扩增、伸长等阶段。内外引物依次进行延伸扩增、置换等步骤，在形成哑铃结构后由内引物为主导进行识别、延伸等作用，最终在短时间内(60min)内合成10⁹～10¹⁰个数量级的茎环结构和多环花椰菜结构状的DNA片段混合物。环引物的加入可导致LAMP反应急剧扩增，反应时间可缩短到原始LAMP反应的一半。

LAMP反应的检测方法可分为非特异性检测和特异性检测两种。非特异性检测包括浊度法、琼脂糖凝胶电泳法和荧光染色法。浊度法是直接目测检验LAMP 反应是否产生白色的副产物焦磷酸镁沉淀；电泳法根据是否产生梯形条带对扩增结果进行判断；荧光染色法使用SYBR Green I等荧光染料对扩增结果进行可视化检验，根据颜色变化判定扩增是否成功。由于部分荧光染料对扩增存在抑制作用，因此需要在反应后加入，但开盖检测存在着导致实验室污染的风险。且由于内引物序列较长易引发产生引物二聚体或发夹结构，如若使用上述3种检测方法检测，将难以判断扩增出的片段是否为目标产物。而特异性检测依靠抗原/抗体或者荧光基团等通过特异性结合来指示反应的进行，搭配实时荧光检测仪可对反应进行实时监测，同时避免了反应后开盖检测的步骤，不仅提高了特异性，更是解决了LAMP反应的假阳性问题。