[发明专利]一种巴西甜突变体及其应用

说明书

本发明涉及基因工程与蛋白质改造技术领域，具体涉及一种巴西甜突变体及其应用。申请人通过蛋白质工程技术，筛选到显著提高巴西甜Brazzein甜度的基因突变位点，并在毕赤酵母中超量表达巴西甜。所述突变体可作为甜味剂，广泛应用于饲料或食品加工领域。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种巴西甜突变体及其应用。

背景技术

甜味剂是食品加工领域不可或缺的重要添加剂。传统的甜味剂如蔗糖、果糖、麦芽糖、葡萄糖，具有食用安全和营养价值，然而存在甜度低，热量高，长期摄入容易引起龋齿、肥胖、心脑血管等疾病。正因为这些弊端，无热量的人工甜味剂相继被开发出来，如：阿巴斯甜，安赛蜜，糖精，纽甜。这些甜味剂得到了广泛使用，但依然存在头晕、头痛等不良反应，其代谢产物对环境和人体健康的安全性难以检测。所以迫切需要寻找一种天然的甜味物质，以满足人们生活需要。

植物甜蛋白作为一种天然产物，因具有安全性高，甜度高，热量低的优点而被人们所关注。植物甜蛋白这些性质使其成为目前低热量高甜度的人工甜味剂的理想替代品。相继有八种植物甜蛋白被发现出来，这些甜蛋白是传统甜味剂和人工甜味剂的最佳替代品之一。其中Brazzein是从西非攀缘植物中提取的甜蛋白，甜度是蔗糖的500-2000倍，而且与其他甜蛋白相比，甜味味觉感受与蔗糖更相似。在pH2.5-8.0范围内，保持稳定，而且耐热性好，易溶于水，适用于各种食品加工工艺。植物中的甜蛋白含量低，提取困难，难以规模化生产。

为了解决植物甜蛋白产量低，难以产业化的问题，近年来，国内外学者利用微生物异源表达甜蛋白，提升甜蛋白产量的报道较多。如大肠杆菌，丝状真菌，动物细胞等，然而这些都共同存在产量不足以用于生产的问题，这也是甜蛋白难以产业化的瓶颈。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，通过蛋白质工程技术，筛选能提高巴西甜Brazzein甜度的基因突变位点，并在毕赤酵母中超量表达巴西甜，以期达到工业化的要求。

本发明一方面涉及一种巴西甜蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明一方面涉及一种巴西甜突变体，所述突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的巴西甜蛋白的第14位氨基酸由Ser变为Arg。

所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

本发明一方面涉及一种巴西甜突变体，所述突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:3的巴西甜蛋白的第22位氨基酸由Cys变为Ala。

所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:6。

本发明一方面涉及一种巴西甜突变体，所述突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:5的巴西甜蛋白的第48位氨基酸由Ile变为Tyr。

所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:8。

本发明还提供了一种重组表达质粒，携带有上述突变体的编码核苷酸序列

本发明还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达质粒。

在本发明的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）。

将上述重组表达质粒转入毕赤酵母宿主细胞中进行重组表达，获得的巴西甜突变体的甜度得到显著提高。

本发明还涉及上述巴西甜突变体在饲料或食品加工领域中的应用。